[发明专利]一种提高拉乌尔菌2,5-呋喃二甲酸产量的方法

说明书

本发明公开了一种提高拉乌尔菌2,5‑呋喃二甲酸产量的方法，属于代谢工程技术领域。本发明利用同源重组的方法同时敲除了产2,5‑呋喃二甲酸的拉乌尔菌中五个5‑羟甲基糠醛还原酶基因。敲除五个基因后的拉乌尔菌在生物转化法生产2,5‑呋喃二甲酸的过程中，转化液中2,5‑呋喃二甲酸含量比出发菌株降低了37.0％，2,5‑呋喃二甲酸的含量增加了23.2％。

技术领域

本发明涉及一种提高拉乌尔菌2,5-呋喃二甲酸产量的方法，属于代谢工程技术领域。

背景技术

2,5-呋喃二甲酸(2,5-Furandicarboxylic acid,FDCA)是一种重要的化工原料和有机合成的前体，可用来制备多种脂类呋喃或烷基取代衍生物，并且被美国能源部列为最有前景的12种平台化合物之一。此外，2,5-呋喃二甲酸还可以作为对苯二甲酸的替代物用来制造聚酯类的塑胶产品，具有广阔的应用前景。

目前，制备2,5-呋喃二甲酸的方法主要有化学合成法和生物转化法。化学合成法一般利用贵金属作为催化剂，需要高压、高温和有机溶剂等条件，从而造成较高的制造成本和严重环境污染问题。生物转化法一般以5-羟甲基糠醛为底物，利用酶或全细胞转化法生成2,5-呋喃二甲酸。与化学合成法相比，生物转化法具有条件温和、低毒和环保等优点。然而由于5-羟甲基糠醛对细胞的毒害作用，只有极少数的微生物可以降解该化合物。其中，解鸟氨酸拉乌尔菌(Raoultella ornithinolytica BF60)可以催化5-羟甲基糠醛生成2,5-呋喃二甲酸，具有较高的底物转化率及应用前景等优势。但是在催化过程中副产物2,5-呋喃二甲醇的生成限制了2,5-呋喃二甲酸的高效合成。

在解鸟氨酸拉乌尔菌催化5-羟甲基糠醛氧化的过程中，5-羟甲基糠醛会首先被还原为2,5-呋喃二甲醇，然后再被逐步氧化生成2,5-呋喃二甲酸。研究发现，在大肠杆菌或酵母中催化5-羟甲基糠醛还原的酶是胞内的多种非特异性氧化还原酶。在解鸟氨酸拉乌尔菌中也存在类似的氧化还原酶，将5-羟甲基糠醛还原为2,5-呋喃二甲醇。因此，本研究通过敲除解鸟氨酸拉乌尔菌中的五个5-羟甲基糠醛还原酶基因，降低副产物2,5-呋喃二甲醇的生成，从而提高2,5-呋喃二甲酸的产量。

发明内容

本发明的目的是通过敲除五个5-羟甲基糠醛还原酶基因(akR、aldR、AdhP1、AdhP2和dkgA)，减少副产物2,5-呋喃二甲醇的生成，进而提高2,5-呋喃二甲酸的产量。发明内容简单易操作，可广泛应用Raoultella属的各种菌株。

本发明的第一个目的是提供一种2,5-呋喃二甲酸产量提高的解鸟氨酸拉乌尔菌，是以解鸟氨酸拉乌尔菌(Raoultella ornithinolytica)BF60(菌株已于论文Hossain,G.S.,Yuan,H.,Li,J.,Shin,H.D.,Wang,M.,Du,G.,Chen,J.,Liu,L.2017.MetabolicEngineering of Raoultella ornithinolytica BF60for Production of 2,5-Furandicarboxylic Acid from 5-Hydroxymethylfurfural.Appl Environ Microbiol,83(1),e02312-16.中公开)为出发菌株，敲除akR、aldR、AdhP1、AdhP2和dkgA中的至少3个基因。

在本发明的一种实施方式中，所述敲除是以Red重组系统进行敲除。

在本发明的一种实施方式中，所述敲除的具体步骤如下：

(1)以pKD13质粒为模板，分别设计含有目标基因akR、aldR、AdhP1、AdhP2或dkgA两侧同源片段的引物扩增出需敲除目的基因的打靶片段；

(2)将(1)中所获得的打靶片段电转化入含有氯霉素抗性基因的pKD46质粒的R.ornithinolytica BF60中，涂布含有卡那霉素抗性的平板，通过菌落PCR验证获得阳性克隆菌株。