[发明专利]采用DNA及PCR技术鉴定新鲜牛肉贮藏时间的方法

权利要求书

1.一种采用DNA及PCR技术鉴定新鲜牛肉贮藏时间的方法，其特征在于该方法由以下步骤组成：

（1）分离提取贮藏牛肉样品中牛DNA，并对DNA含量进行检测；

（2）以提取的牛DNA为模板，利用牛线粒体基因和内参基因β-globin2的引物分别进行荧光定量PCR扩增，获得牛线粒体基因与内参基因扩增产物的ct值，计算Δct值，Δct值的计算公式为：Δct=∣ct_{牛线粒体基因}-ct_内参基因∣；其中，所述内参基因β-globin2的引物序列如下：

上游引物：5’-CGGCGGCGGGCGGCGCGGGCTGGGCGGGAAGGCCCATGGCAAGAAGG-3’；

下游引物：5’-GCCGGCCCGCCGCGCCCGTCCCGCCGCTCACRCAGCGCAG

CAAAGG-3’；

所述牛线粒体基因的引物序列如下：

上游引物为5’-CCCATTTCACCCTTACTACACCA-3’；

下游引物为5’-ATTGA GTGGATTTGCTGGGATA-3’；

（3）-20℃温度下贮藏11个月以内的牛肉样品，若DNA含量大于950μg/g，说明牛肉样品是一级鲜肉；若DNA含量在950μg/g以下，说明牛肉样品是一级鲜肉或二级鲜肉，将牛肉样品继续贮藏1天，若DNA含量增加说明牛肉样品是二级鲜肉，若DNA含量减小说明牛肉样品是一级鲜肉；牛肉样品为一级鲜肉时，贮藏时间与Δct值拟合的数学方程为Y₁= 0.8489X-8.0306，其中Y₁代表贮藏月数，X代表Δct值，R²= 0.9142；牛肉样品为二级鲜肉时，贮藏时间与Δct值拟合的数学方程为Y₁ = -14.185X +172.63，R² = 0.9506；

4℃温度下贮藏5天以内的牛肉样品，若DNA含量大于750μg/g，说明牛肉样品是一级鲜肉；若DNA含量在750μg/g以下，说明牛肉样品是一级鲜肉或二级鲜肉，将牛肉样品继续贮藏1天，若DNA含量增加说明牛肉样品是二级鲜肉，若DNA含量减小说明牛肉样品是一级鲜肉；若牛肉样品为一级鲜肉，贮藏时间与Δct值拟合的数学方程为Y₂=0.793X-7.3563，其中Y₂代表贮藏天数，R²=0.9899；若牛肉样品为二级鲜肉，贮藏时间与Δct值拟合的数学方程为Y₂ =-1.3227X+17.656，R²=0.9607。

2.根据权利要求1所述的采用DNA及PCR技术鉴定新鲜牛肉贮藏时间的方法，其特征在于分离提取贮藏的牛肉样品中牛DNA的方法为：

（1）称取0.3g牛肉糜于2mL离心管中，加入550μL DNA提取缓冲液、150μL 5% SDS裂解液及18μL 20mg/mL的蛋白酶K水溶液，于55℃下水浴消化4小时，然后加入700μL苯酚，摇晃10min，于12000r/min下离心10min；

（2）取上清液置于新离心管中，加入400μL苯酚与氯仿、异戊醇体积比为25:24:1的混合液，摇晃10min，于12000r/min下离心10min，再将上清液置于新离心管中，加入400μL氯仿与异戊醇体积比为24:1的混合液，摇晃10min，于12000r/min下离心10min；

（3）重复步骤（2）一次，取上清液置于新离心管中，加入800μL的冰无水乙醇，反复摇匀后，置于冰箱中-18℃静置30min，静置后于12000r/min下离心10min，弃去上层清液，加入体积分数为75%的冰乙醇水溶液，用枪头反复吹打离心管中的溶液，然后于12000r/min下离心10min，弃去上层清液在通风橱内风干30min后，加入50μL TE溶解DNA，置于冷藏冰箱中，-20℃保存备用。

3.根据权利要求1所述的采用DNA及PCR技术鉴定新鲜牛肉贮藏时间的方法，其特征在于所述荧光定量PCR扩增的反应体系为：DNA 1μL，2×Ultal SYBR Mixture 5μL，上、下游引物各0.3μL，ddH₂O 3.4μL。

4.根据权利要求1所述的采用DNA及PCR技术鉴定新鲜牛肉贮藏时间的方法，其特征在于所述荧光定量PCR扩增的反应程序为：95℃变性10min，以95℃ 15s、63℃ 30s、72℃ 30s扩增40个循环。