[发明专利]用于治疗勃起功能障碍的脐带间充质干细胞及其外泌体的联合制剂和其制备方法与给药方法

说明书

本发明公开了一种用于治疗勃起功能障碍的脐带间充质干细胞及其外泌体的联合制剂和其制备方法与给药方法，包括脐带间充质干细胞以及通过饥饿培养获得脐带间充质干细胞外泌体浓缩液。通过对脐带间充质干细胞饥饿培养的方法，促进其生物活性物质的分泌。以外泌体的形式回收脐带间充质干细胞分泌的生物活性物质，大大提高了回收效率、回收方式更为简便。通过不同孔径的生物膜梯度过滤的方法，收集并浓缩脐带间充质干细胞分泌的外泌体，简化了外泌体回收的流程，提高了外泌体的纯度。

技术领域

本发明涉及脐带间充质干细胞及其外泌体的联合制剂，尤其是一种用于治疗勃起功能障碍的脐带间充质干细胞及其外泌体的联合制剂和其制备方法与给药方法。

背景技术

勃起功能障碍(erectile dysfunction，ED)是最常见的一种男性性功能障碍，指阴茎持续不能达到或维持足够的勃起以完成满意性生活，病程3个月以上。ED一般可分为器质性ED、手术或外伤性ED、精神性ED、阴茎自身病变等，常规的治疗方法可通过口服药物治疗，但药物治疗依赖性强，不能达到根治的目的。脐带间充质干细胞属于成体干细胞，具有多向分化、组织修复、免疫调节等多种功能，因其免疫原性极低，异体使用不会引起免疫排斥，故在临床应用中具有极大的优势。研究显示，脐带间充质干细胞能够一定程度上治疗和缓解ED症状。但是，直接静脉回输脐带间充质干细胞由于细胞难于到达阴茎部位，所以治疗效果有限。

研究发现，脐带间充质干细胞行使生物学功能的一个最重要途径是通过分泌大量生物活性因子，进而调节病变组织的机能、促进血管再生、加速组织再生修复。而大量的生物活性因子的分泌途径主要是通过外泌体，一种生物膜包裹的、直径在40-200nm不等的分泌小泡。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，提供一种用于治疗勃起功能障碍的脐带间充质干细胞及其外泌体的联合制剂和其制备方法与给药方法，通过饥饿培养脐带间充质干细胞的，并进行富集浓缩的方法，获得高浓度的具有生物活性的脐带间充质干细胞外泌体，以此为溶剂，制备脐带间充质干细胞悬液，通过微针局部导入的方法治疗ED。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种用于治疗勃起功能障碍的脐带间充质干细胞及其外泌体的联合制剂的制备方法，包括以下步骤：

(1)人脐带间充质干细胞的培养：选取生长状态良好的，微生物检测均为阴性的，P2-P8的人源脐带间充质干细胞，按照3-5*10⁴/cm²的初始密度接种于细胞培养瓶或细胞培养皿中，培养基为基础培养基中含有体积比浓度5-15％的胎牛血清的培养体系；

(2)接种培养2-4天后，细胞融合率达到80-95％，细胞生长状态良好，吸弃全部培养上清，并以医用复方电解质注射液清洗细胞2-4次，然后加入复方电解质溶液，使溶液高度达到2-3mm，放入二氧化碳培养箱中饥饿培养；

(3)饥饿培养18-30h后，回收全部培养上清，以0.22um孔径滤膜过滤，过滤后的培养上清在3000-5000g的离心力条件下离心10-20min，再次回收离心上清；

(4)在200000-500000g的离心力条件下对回收的上清离心30-60min，离心后轻轻取出离心管，以移液管吸弃上部70％-90％体积的液体，将下部10％-30％体积的液体及沉淀混合均匀后作为制备ED治疗制剂的外泌体溶剂，在2-8℃条件下保存；

(5)人脐带间充质干细胞的培养：选取生长状态良好的，微生物检测均为阴性的，P2-P8的人源脐带间充质干细胞，按照3-5*10⁴/cm²的初始密度接种于细胞培养瓶或细胞培养皿中，培养基为基础培养基中含有体积比浓度5-15％的胎牛血清的培养体系；