[发明专利]基于石墨烯的QuEChERS法建立脂溶性贝类毒素的UPLC-MS/MS检测方法

说明书

本发明涉及基于石墨烯的QuEChERS法建立脂溶性贝类毒素的UPLC‑MS/MS检测方法。本发明建立了贝类水产品中9种脂溶性贝类毒素的UPLC‑MS/MS定量检测方法：该方法具有快速、简便、高效、回收率高、有机溶剂接触少、省时等优点；建立的QuEChERS样品前处理技术，结合冷冻除脂技术以及氧化石墨烯的高吸附特性，可以有效去除复杂基质(如游离脂肪酸和色素)，获得较好的脂溶性贝类毒素的检测回收率效果，净化效果良好，引入低温冷冻技术辅助QuEChERS法对样品的净化效果，可显著减少基质效益，提高方法的灵敏度；结合超高液相色谱串联质谱技术，成功应用贝类样品中脂溶性贝类毒素的检测，可同时检测9种脂溶性贝类毒素，比现有标准方法显著增加5种，具有较好的适用性。

技术领域

本发明涉及脂溶性贝类毒素的检测方法，尤其涉及一种减少基质效益，提高方法的灵敏度的基于氧化石墨烯的QuEChERS法建立脂溶性贝类毒素的UPLC-MS/MS多组分定量检测方法。

背景技术

海洋生物毒素(贝类毒素)特指主要由海洋有毒微藻或微生物产生、能够在海洋生物尤其是双壳贝类中富集的、对其他生物包括人类产生危害的一大类小分子有毒化学物质。针对这些生物毒素，研究者初期主要根据所引起的中毒症状将其分为六大类：麻痹性贝类毒素(Paralytic Shellfish Poisoning，PSP)、腹泻性贝类毒素(Diarrhetic ShellfishPoisoning，DSP)、神经性贝类毒素(Neurotoxic Shellfish Poisoning，NSP)、记忆缺失性贝类毒素(Amnesic Shellfish Poisoning，ASP)、西加鱼毒素(Ciguatera FishPoisoning，CFP)、蓝绿藻毒素。不过随着研究的深入，新的生物毒素种类不断被发现，且多种毒素如OA往往与毒素AZA和PTX伴生而成，但具有不同的致毒机理，原有分类方法已不能满足管理和科研的需求。因此，2004年，由联合国粮农组织、世界卫生组织和政府间海洋委员会共同组建的双壳类软体生物毒素工作组将贝类毒素分为八大类，分别为石房蛤毒素组(Saxitoxin，STX)、软骨藻酸组(Domoic acid，DA)、大田软海绵酸毒素组(Okadaic acid，OA)、原多甲酸毒素组(Azaspiracid，AZA)、短裸甲藻毒素组(Brevetoxin，BTX)、蛤毒素组(Pecenotoxins，PTX)、虾夷扇贝毒素组(Yessotoxin，YTX)和环亚胺类毒素(Cyclicimines，CIs)。除此之外，水螅毒素(Palytoxins，P1TX)和西加鱼毒素(Ciguatoxins，CTX)也正在被考虑是否划作贝类毒素中。

现有8大类贝类毒素中，STX和DA毒素组较易溶解于水，比较而言OA、AZA、BTX、PTX、YTX、CIs均为聚醚类物质，具热稳定性，易溶解于甲醇、乙醚等非极性有机试剂中，因此被统一称作为脂溶性贝类毒素(lipophilic phycotoxins，LPs)。贝类毒素的严重危害性已引起多个国家的密切关注，以欧美加等为首的发达国家相继制定了贝类毒素监控国家计划。传统的监控方法主要是定期对相关海域中的双壳贝类进行贝类毒素的含量及产毒藻种类和数量进行监测，以评估贝类毒素的风险性，对保护消费者安全，确保贝类产业健康发展做出了积极贡献。然而，传统手段需要采集大量的贝类和藻类样品才能对贝类毒素做出有效预警，不仅耗费大量的人力物力，而且时效性不强。2004年，MacKenzie等人首次报道了一种固相吸附毒素追踪技术(Solid phase adsorption toxin tracking，SPATT)，主要是利用特异性吸附材料对目标毒素进行吸附，然后实验室内洗脱、浓缩和净化后经LC-MS检测。SPATT技术与传统方法相比，不仅大量减少采样分析工作量，而且还可以监控目标海域不同水层贝类毒素的变化，同时结合贝类中毒素和有毒藻的变化情况，对贝类毒素有早期预警作用，具有很大的发展前景。现有的检测技术主要还是小鼠生物法，存在动物福利以及检出限高且不能明确辨析贝毒成分等问题，虽然质谱检测技术也已开始用于贝类毒素的检测，但检测种类比较单一，或前处理方法尚需进一步完善。

发明内容