[发明专利]TRIM31沉默对胰腺导管腺癌细胞增殖的检测方法

权利要求书

1.一种TRIM31沉默对胰腺导管腺癌细胞增殖的检测方法，其特征在于，所述TRIM31沉默对胰腺导管腺癌细胞增殖的检测方法采用实时荧光定量聚合酶链反应和Western blot检测TRIM31在人胰腺导管腺癌细胞系以及正常人胰腺上皮细胞系中的表达量，并选取两株胰腺导管腺癌细胞系进行后续实验。

2.如权利要求1所述的TRIM31沉默对胰腺导管腺癌细胞增殖的检测方法，其特征在于，所述TRIM31沉默对胰腺导管腺癌细胞增殖的检测方法包括以下步骤：

步骤一，细胞培养：正常胰腺导管上皮细胞HPDE、胰腺导管腺癌细胞AsPC-1、BxPC-3用含10％胎牛血清的RPMI 1640培养基，MIAPaCa-2及Panc-1用含10％胎牛血清的RPMI DMEM培养基，两组细胞均置于37℃、5％CO₂的恒温培养箱中培养；

步骤二，RT-qPCR和Western blot法检测各细胞系中TRIM31表达量取适量处于对数生长期的各细胞，提取细胞总RNA及蛋白；选取吸光度度1.8-2.0(A260/A280)之间的RNA样本用于实验；再根据逆转录试剂盒说明书，分别逆转录为cDNA；qRT-PCR反应检测TRIM31在各细胞系中的表达量，并以GAPDH作为内参，对表达量采用2^-ΔΔCt法计算相对表达；Westernblot法检测各细胞系的TRIM31蛋白表达量；

步骤三，沉默TRIM31及沉默效率检测：选取两株胰腺导管腺癌细胞进行后续实验，将两株细胞分别分为TRIM31沉默组(实验组)和空载体组(阴性对照组)；取2×10⁵个对数生长期细胞分别接种于6孔板中，待细胞贴壁后利用lipofectamine3000将3条siRNA-TRIM31片段及对照siRNAs分别转染两株细胞；48h后收集细胞，提取RNA；72h后收集细胞，提取蛋白；通过RT-qPCR和Western blot检测siRNA对TRIM31的沉默效率；

步骤四，检测细胞增殖采用CCK8法；转染siRNA48h后收集细胞，以3×10³个/孔细胞接种于96孔板中，每组分别设0、1、2、3及4d组，每个时间点设置5个复孔；检测前每孔分别加入CCK8试剂10uL，避光37℃孵育2h，轻轻振荡后，酶标仪450nm波长处测定光密度(OD)值，观察TRIM31对胰腺癌细胞增殖的影响；

步骤五，人胰腺导管腺癌细胞单克隆形成能力采用细胞平板克隆实验，转染siRNA 24h后收集细胞以5×10³个/孔细胞接种于6cm培养皿中，37℃培养箱中培养7-8天后，4％多聚甲醛固定30分钟，0.1％结晶紫染色30分钟，计数每孔克隆形成数量并拍照记录；

步骤六，mTOR激活剂对TRIM31沉默细胞增殖能力的影响；转染siRNA 48h后在培养基中加入适量mTOR激活剂雷帕霉素，终浓度2umol/L；24h后提取细胞总蛋白，western blot检测mTOR及p-MTOR蛋白表达量与阴性对照组及TRIM31沉默组之间的差异；CCK8法检测各组细胞增殖能力。