[发明专利]一种香菇遗传转化的方法

说明书

本发明公开了一种香菇遗传转化的方法，涉及香菇分子遗传转化技术领域。该方法首次以不完全酶解的香菇菌丝碎片为转化受体，采用电击转化法，在电压：1800‑2200kV/cm，电容：20‑30μF，电阻：380‑420Ω的条件下进行电击转化，省去了复杂的香菇原生质体制备步骤，可以有效提高转化效率以及转化体的再生率，且该方法也可适合单核体的转化。

技术领域

本发明涉及香菇分子遗传转化技术领域，具体而言，涉及一种香菇遗传转化的方法。

背景技术

目前，现有的香菇遗传转化受体常用的是原生质体、孢子或者子实体。香菇原生质体制备过程复杂而且再生率低。孢子和子实体不适合单核体的转化，而且有些实验室并没有出菇的条件。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种香菇遗传转化的方法，该方法结合电击转化法，以不完全酶解的香菇菌丝碎片作为转化受体，可有效提高再生率。

本发明是这样实现的：

一种香菇遗传转化的方法，其包括：电击转化步骤；

上述电击转化步骤包括：将不完全酶解的香菇菌丝碎片与带有目的基因的质粒混合在电击条件下进行电击转化。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，电击转化的条件为：电压：1800-2200kV/cm，电容：20-30μF，电阻：380-420Ω。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，将不完全酶解的香菇菌丝碎片与质粒混合于电击缓冲液中进行电击转化，上述电击缓冲液含有：0.55-0.65M甘露醇和9-11mM磷酸钠，pH6.8-7.2。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，在电击转化步骤之前，上述方法还包括菌丝碎片制备步骤；

上述菌丝碎片制备步骤包括：将香菇湿菌丝与溶壁酶酶液混合，于28-30℃条件下酶解1.5-2.5h，离心收集沉淀，即得不完全酶解的香菇菌丝碎片。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，将香菇湿菌丝与溶壁酶酶液混合是指：按每280-320mg的香菇湿菌丝对应0.8-1.2ml溶壁酶酶液的比例进行混合；其中，溶壁酶酶液中含有1.8％-2.2％的溶壁酶。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，在菌丝碎片制备步骤之前，上述方法还包括：湿菌丝制备步骤；

上述湿菌丝制备步骤包括：

步骤(a)：将香菇菌种接种至PDA平板上，待长满菌丝后，粉碎后，接种于PDB液体培养基中培养，得到培养物；

步骤(b)：将培养物粉碎后，接种于PDB液体培养基中培养，培养结束后，过滤收集菌丝，用甘露醇溶液洗涤，离心，收集沉淀，即得湿菌丝。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，在步骤(a)中，在PDB液体培养基中培养时的培养条件为：温度24-26℃，静置培养4-6d。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，在步骤(b)中，在PDB液体培养基中培养时的培养条件为：温度24-26℃，静置培养3-5d，培养期间间或摇匀培养基。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，在步骤(b)中，所用甘露醇溶液浓度为0.55-0.65M，离心条件为：转速5500-6500rpm、离心时间：9-11min。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，在电击转化步骤之后，上述方法还包括：筛选步骤；

上述筛选步骤包括：

将经电击转化后的菌丝与第一筛选培养基混合，再将第一筛选培养基转入处于凝固状体的第二筛选培养基上，进行再生培养；