[发明专利]诱导分化睾丸间质细胞的方法及其在性功能恢复中的应用

权利要求书

1.一种诱导分化睾丸间质细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤:

(1)间充质干细胞的培养:将间充质干细胞单体按4-6×10⁵/ml接种于干细胞培养液中，并置于38℃的培养箱内，以1℃/天的速度降至36℃，后一直恒温保持在36℃，之后每2-3天换液传代一次，收获4-6代间充质干细胞，然后用体积比为2:1.5的0.3％胶原酶和0.25％胰蛋白酶先后加入进行消化25-40min，再通过振荡器震荡10-12min，得到培养扩增的间充质干细胞；其中干细胞培养液为DMEM和F12按体积比1.5:1混合后并加入3％FBS作为基础培养液，还含有55ng/ml EGF、15ng/ml bFGF、3％非必需氨基酸、0.3mM GABA、1.5％复合维生素，余量为超纯水；

(2)诱导分化睾丸间质细胞:将步骤(1)得到的间充质干细胞按照4-6×10⁴/ml的细胞密度贴壁在二氧化钛纳米管容器上诱导培养，贴壁培养2天后更换诱导培养液进行培养，3-4天后半量换液，5-6天时终止诱导；其中诱导培养液为DMEM作为基础培养基，还含有8％FBS、80U/ml青霉素、60μg/ml青链霉素、35μg/ml微量元素化合物、25μg/ml谷氨酰胺、150uM二丁酰环磷腺苷、17μg/ml丙氨酰谷氨酰胺、15ng/ml EGF和4ng/ml LH，余量为超纯水。

2.根据权利要求1所述的一种诱导分化睾丸间质细胞的方法，其特征在于，所述复合维生素为维生素A、维生素B2、维生素C、维生素E、维生素H以质量比为1:1.5:0.8:2:1组成的。

3.根据权利要求1所述的一种诱导分化睾丸间质细胞的方法，其特征在于，所述微量元素化合物为硫酸锌、氯化铁、氯化钾、碘酸钾以质量比为2:1.5:1:0.9组成的。

4.根据权利要求1所述的一种诱导分化睾丸间质细胞的方法，其特征在于，所述间充质干细胞的制备方法中采用的酶液为体积比3:2的0.25％胰蛋白酶与0.2％胶原酶混合的混合酶液。

5.根据权利要求1所述的一种诱导分化睾丸间质细胞的方法，其特征在于，所述间充质干细胞的制备方法包括以下步骤:

(1)抽取用药患者脂肪组织15ml，利用清洗液冲洗后，将脂肪组织破碎至直径2-3mm的脂肪粒块，再利用清洗液清洗2-3次；

(2)在所述脂肪粒块中加入体积比3:2的0.25％胰蛋白酶与0.2％胶原酶的混合酶液，并不断以50-60rpm的速度进行搅拌，在恒温37℃下消化50-70min；

(3)消化处理后，再经过230目筛后利用离心机以800-1300rpm离心3-5min，吸出下层细胞液移至间充质干细胞培养液中培养后得到间充质干细胞；

(4)将制备的间充质干细胞冻存于-196℃的深低温中，以便后续使用。

6.根据权利要求4所述的一种诱导分化睾丸间质细胞的方法，其特征在于，所述步骤(3)中放置于间充质细胞培养液中培养，是指待组织块周围有梭型细胞爬出后，培养至80-90％细胞融合。

7.一种睾丸间质细胞在性功能恢复中的应用，其特征在于，将所述睾丸间质细胞制备成性功能恢复药物。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述性功能恢复药物按照重量百分比计包括:10-13％睾丸间质细胞、7-9％人血白蛋白原液、1.6-2.3％葡萄糖酸锌、2.1-3.6％类黄酮素、0.4-0.6％亭扎肝素钠、3-7％熟地黄浓缩液、4-5％维生素E、0.2-0.3％硫辛酸、3.7-5.8％LH、1.3-1.7％谷氨酰胺、0.3-0.7％乳化剂、1-2％稳定剂、0.6-0.7％pH调节剂，余量为生理盐水。

9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述性功能恢复药物的制备方法包括以下步骤:

(1)将睾丸间质细胞用所述人血白蛋白原液进行稀释，在37℃恒温下，以100rpm的转速缓缓搅拌10-15min，得到稀释细胞溶液；

(2)将所述熟地黄浓缩液、葡萄糖酸锌、亭扎肝素钠依次用40％、30％、30％的所述生理盐水进行溶解，在通过超声波分散3-5min后，分别得到熟地黄溶液、葡萄糖酸锌溶液、亭扎肝素钠溶液，将所述三种溶液混合，加热至55℃搅拌3-5分钟，静置冷却至室温，形成混合溶液；

(3)将所述混合溶液与所述稀释细胞溶液进行混合，以150rpm的速度进行搅拌5-7min，得到混合细胞溶液，混合期间溶液温度恒温37℃；

(4)再将类黄酮素、维生素E、硫辛酸混合后加入所述混合细胞溶液中，在37℃恒温下通过超声波分散辅助混合，经过20-25min后，再加入LH和谷氨酰胺以100rpm的速度进行搅拌2-3分钟，得到药物混合溶液；

(5)在所述药物混合溶液中加入乳化剂、稳定剂，以120rpm速度搅拌5-10min，期间通过加入所述pH调节剂至药物混合溶液pH＝7.1-7.3，即得到睾丸间质细胞制成性功能恢复药物的注射液。