[发明专利]一种环介导等温扩增结合基因芯片的检测方法

说明书

一种环介导等温扩增结合基因芯片的检测方法，在LAMP体系下进行环介导等温扩增反应，并将探针固定在芯片表面，然后将扩增产物与芯片进行杂交反应，通过可见光光学放大杂交信号检测结果。本发明具有较高的特异性与准确性，操作简单，不需要依托大型仪器设备，满足医院临床的快速现场检测需求。

技术领域

本发明属于分子检测领域，涉及一种环介导等温扩增结合基因芯片的检测方法。

背景技术

环介导等温扩增，英文名称为loop-mediated isothermal amplification，是2000 年由日本科学家Notomi T. 首次在Nucleic Acids Research 杂志上报道的一种新颖的恒温核酸扩增方法。该方法具有以下特点：具有较强的特异性，只有当引物组与靶序列的6-8个区域都同时匹配上时才能有效扩增；反应体系稳定可靠且有良好的抗干扰能力，在室温下放置2周后仍然有效，对于样品中原有的或被污染的干扰片段不敏感，而这是其它核酸扩增技术无法做到的；敏感性较高，扩增快速、高效，1h内扩增产物量可达约1010拷贝数，扩增效率和检测灵敏度可比普通PCR高10-100倍左右；结果鉴别相对简便，多样化，如检测反应管的沉淀浊度、检测反应管颜色变化等方法能判断扩增与否。LAMP技术对于样品处理、操作技术和仪器设备的要求都比较低，更适宜现场检测或条件较差的基层使用。

基因芯片技术是同时将大量的探针分子固定到固相支持物上 , 借助核酸分子杂交配对的特性对 DNA 样品的序列信息进行高效的解读和分析。采用基因芯片进行检测，其检测通量大，在一张芯片上可以同时对一种病原物的多个基因进行检测或者一次性完成几种病原体检测，直接针对病原体基因进行，结果更准确，具有检测灵敏度高、特异性好，所需样本量少等优点。

传统的基因芯片技术的检测，是基于荧光标记探针的荧光发光来进行检测的。其信号弱，必须经过激发，才能发光，需要昂贵的激光扫描设备。本发明基因芯片利用化学发光检测杂交信号，在常温下即可完成杂交过程，不需要大型仪器设备，降低了检测的投资成本和应用成本。

发明内容

本发明一种高特异性与准确性，操作简单，结果直观准确的环介导等温扩增结合基因芯片的检测方法。

本发明提供的一种环介导等温扩增结合基因芯片的检测方法，包括：

第一步，环介导等温扩增反应

配制环介导等温扩增体系如下：1. 4M betaine , 200 μM dNTPs , 1×IsothermalAmplification Buffer Ⅱ, FIP/BIP引物各1.6 μM, F3/B3引物各0.2μM，LF/LB引物各0.4Μ，50～150ng/μL的扩增模板1μL，总体系25μL。63℃水浴40min扩增，80℃水浴10min终止反应。

第二步，芯片制作

取1μL浓度为200ng/μL的探针点样到NC上，每组设两个平行点样点，紫外交联20min固定探针，使用杂交液封闭30min，真空干燥，4℃保存。

第三步，杂交显色

将环介导恒等温扩增产物 95℃加热 3 分钟，迅速置于冰上；取10μl PCR产物与2mL杂交缓冲液混合，与芯片一起放入杂交盒中，在常温下，于水平摇床上孵育60min；使用杂交缓冲液清洗2次，每次5min；清洗后，将亲和素（辣根过氧化物酶标记）加入到杂交盒中，孵育10min；用洗涤液清洗3次，每次5min；在晾干的基因芯片上点样ECL显色液，使用全自动化学发光图像分析系统显色。

进一步地，所述的环介导恒等温扩增引物为：FIP、BIP引物，序列分别为：SEQ IDNO.1～2；F3、B3引物，序列分别为：SEQ ID NO.3～4；其中BIP引物的5’端带有生物素标记。