[发明专利]猪流行性腹泻病毒S蛋白及其亚单位疫苗及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种猪流行性腹泻病毒S蛋白及其亚单位疫苗及其制备方法和应用。该疫苗包含30～200μg重组猪流行性腹泻病毒S蛋白以及药学上可接受的ISA 201VG佐剂。其制备方法包括以下步骤：(1)重组猪流行性腹泻病毒S蛋白基因的克隆；(2)重组猪流行性腹泻病毒S蛋白的表达和纯化；(3)将(2)中制备的重组猪流行性腹泻病毒S蛋白制备成水相；(4)将水相与ISA 201VG佐剂按照体积比46:54的比例乳化，得到疫苗。该疫苗安全性高、免疫原性好、批次间稳定、生产成本低、免疫原性强；另一方面首次成功构建并筛选了悬浮稳定高效表达PEDV‑S蛋白的CHO细胞株，该细胞株表达PEDV‑S蛋白产量高，其产量能够达到1g/L，表达的PEDV‑S蛋白易于纯化。

技术领域

本发明涉及一种猪流行性腹泻病毒S蛋白及其亚单位疫苗及其制备方法，以及一种悬浮稳定高效表达猪流行性腹泻病毒S蛋白的CHO细胞株及构建、筛选该细胞株的方法，属于动物疫苗与兽用生物制品技术领域。

背景技术

猪流行性腹泻(Porcine Epidemic Diarrhea，PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine Epidemic Diarrhea Virus，PEDV)引起的一种以呕吐、腹泻和脱水为主要症状的肠道传染病。该病对各种年龄阶段的猪均易感，尤其是7日龄以内的哺育仔猪，感染后死亡率高达50％-90％。近几年，该病在我国的发病率、死亡率均呈上升趋势，给养猪行业造成了重大经济损失。

PEDV属于冠状病毒科冠状病毒属1群，具有典型的冠状病毒形态。PEDV粒子为多型性，倾向球状，外周包裹有囊膜，囊膜上还覆有放射状纤突，直径平均约为130nm。S蛋白为伸出病毒颗粒囊膜的20nm球杆形糖蛋白，分子量约为180-220kDa，约由1383个氨基酸组成，该蛋白富含半胱氨酸，含有29个潜在N-糖基化位点，但是N-糖基化位点在病毒粒子成熟后不能被蛋白酶切割，大大降低了该病毒的细胞融合力和感染力，这也是PEDV人工细胞培养困难的重要原因之一。根据PEDV与其它冠状病毒S蛋白的保守序列的相似性，将PEDV S蛋白划分为S1(1-789aa)和S2(790-1383aa)两个结构域，其中S1位于病毒表面，主要作用在于识别受体并与宿主细胞受体相结合，并介导中和抗体的产生。S2主要负责病毒囊膜与宿主细胞膜的融合，并将病毒RNA导入宿主细胞内，从而引起细胞的感染。另外，PEDV S蛋白也是诱导宿主体液免疫反应的免疫原蛋白。因此，PEDV S蛋白是目前研发基因工程亚单位疫苗的候选蛋白。

目前市场上用于预防、控制猪流行性腹泻的疫苗基本都是传统PEDV弱毒苗和灭活疫苗。但是灭活疫苗存在自身免疫保护力较弱，且存在灭活不完全，造成散毒的风险；弱毒活疫苗存在毒株毒力返强的风险。随着分子生物学技术的飞速发展和研究的不断深入，研究者开始将PEDV疫苗的研发方向转为具有潜在优势的基因工程疫苗，该疫苗具有安全、高效、副作用小、表达量高、可工业化生产等优点。近年来，有很多研究集中在PEDV S1蛋白的表达和疫苗研究(如中国专利申请号为201610348237.8的发明专利中使用昆虫杆状病毒表达S1区21-789位的蛋白)，以及将S蛋白的核心区域的串联表达(如中国专利申请号为201610256701.0的发明专利中使用大肠杆菌串联表达S蛋白的3个核心区域)。这主要是因为PEDV S蛋白过大(约1383aa)，无论是基因克隆还是蛋白表达制备，在分子生物学的技术层面上都是比较难以实现的。但是仅仅使用截短或者不完全的PEDV蛋白作为抗原，存在抗原表位不全、整体免疫原性相对全长较差等不足之处，可能导致免疫保护力度不够。另外，目前的表达系统大部分选择原核或昆虫杆状病毒表达系统，普遍存在着翻译后没有糖基化修饰或者糖基化修饰不够，从而使表达后蛋白的免疫原性不及病毒颗粒本身的蛋白，可能导致保护力度不足。