[发明专利]基于小鼠不同区段小肠的体外类器官3D培养、传代、冻存、复苏和鉴定方法

权利要求书

1.基于小鼠不同区段小肠的体外类器官3D培养、传代、冻存、复苏方法，其特征在于包括以下几个步骤：

步骤一、收集一只8-10周大的雄性C57BL/6小鼠的小肠，放入预冷的无钙、镁离子磷酸盐缓冲溶液中，置于冰上；用眼科镊清除小肠残留肠系膜，将小肠从十二指肠段沿纵轴纵向剖开，用预冷的无钙、镁离子磷酸盐缓冲溶液清洗去除肠道中的食糜，得到清洗干净的小肠；将清洗完毕的小肠分成三等分，分别剪取前端靠近胃部的4厘米小肠作为十二指肠段，中间段小肠的中间部4厘米为空肠段，后端靠近回盲肠部的4厘米为回肠段；将三段小肠部位用无水乙醇中浸泡5分钟后，用消毒盖玻片沿小肠绒毛面轻轻刮三段小肠部位2-3次；用预冷的无钙、镁离子磷酸盐缓冲溶液清洗三段小肠；用眼科剪将三段小肠沿纵轴剪成3-5毫米的小段，将十二指肠段放于含8毫升预冷的无钙、镁离子磷酸盐缓冲溶液的离心管1中清洗，将空肠段放于含8毫升预冷的无钙、镁离子磷酸盐缓冲溶液的离心管2中清洗，将回肠段放于含8毫升预冷的无钙、镁离子磷酸盐缓冲溶液的离心管3中清洗，清洗时分别将离心管1、2和3轻轻来回颠倒10-15次；清洗完毕后，将离心管1、2和3分别置于冰上使小肠碎片自然沉降于离心管1、2和3底部，然后去除上清液；分别在离心管1和2中加入8毫升预冷的浓度为2mM，pH为8.0的乙二胺四乙酸溶液后，横向埋于冰盒中用回旋式摇床以40-50rpm的速度振荡30分钟进行消化；在离心管3中加入8毫升预冷的浓度为5mM，pH为8.0的乙二胺四乙酸溶液后，横向埋于冰盒中用回旋式摇床以40-50rpm的速度振荡45分钟进行消化；将离心管1、2和3分别置于冰上自然沉降，去除上清液；向离心管1、2和3中分别加入预冷的无钙、镁离子磷酸盐缓冲溶液后，将离心管1、2和3分别上下颠倒10-15次进行清洗；

步骤二，将步骤一中清洗完成的离心管1、2和3置于冰上自然沉降，去除上清液后，分别加入7.5毫升预冷的无钙、镁离子磷酸盐缓冲溶液，轻柔振荡50次，脱出小肠碎片中的隐窝，随后将离心管1、2和3置于冰上自然沉降后，将离心管1、2和3上清液合并收集至50毫升离心管4中；采用100微米孔径的细胞筛对离心管4中的上清液进行过滤，滤液转移至50毫升离心管5中；重复多次，直至每100微升离心管4中的收集液中少于10个隐窝时，停止收集；

步骤三、将步骤二中得到的含有隐窝的离心管5以150g转速和4℃温度下离心10分钟；去除离心管5中的上清液，加入3毫升预冷的无钙、镁离子磷酸盐缓冲溶液后，得隐窝悬液，移液枪吸取20微升隐窝悬液，滴于载玻片上，倒置显微镜下计数隐窝数量；将隐窝悬液转移到15毫升离心管6中以150g转速和4℃温度下离心10分钟，去除离心管6中的上清液，得隐窝沉淀，并将隐窝沉淀置于冰上；

步骤四、向步骤三中得到的隐窝沉淀中按照每孔50微升的剂量加入相应体积的冰上预融化的复合凝胶液，用预冷移液枪头在冰上轻轻吹打形成均匀小肠隐窝复合凝胶悬液1；将小肠隐窝复合凝胶悬液1按照每孔50微升体积接种于37℃预热的24孔培养板1中；将24孔培养板1置于温度为37℃的二氧化碳培养箱中30分钟；待复合凝胶完全聚合后，再向24孔培养板1的每孔中加入500微升完全培养基，每3天更换一次完全培养基，得到初代小肠类器官；

步骤五、在步骤四接种后6天，去除步骤四中24孔培养板中培养基，然后在每孔中加入500微升预冷的无钙、镁离子磷酸盐缓冲溶液后置于冰上，用移液枪反复吹打每个孔的复合凝胶至破碎，得到复合凝胶悬液2；用注射器吸取全部复合凝胶悬液2后推出，重复一次，使隐窝类似结构从小肠类器官中释放，得到解离小肠类器官悬液1；将解离小肠类器官悬液1转移至15毫升离心管7中，以200g转速和4℃温度下离心10分钟，去除离心管7中上清液；向含有解离小肠类器官悬液1的离心管7中加入150-250微升冰上预融化的复合凝胶液，用移液枪吹打3-4次制成冰上预融化的复合凝胶悬液3；将复合凝胶悬液3按照每孔50微升体积接种于37℃预热24孔培养板2中；将24孔培养板2置于温度为37℃的二氧化碳培养箱中30分钟；待复合凝胶完全聚合后，再向24孔培养板2的每孔中加入500微升完全培养基，每3天更换一次完全培养基，得到传代小肠类器官；

步骤六、在步骤五小肠类器官传代3天后，将24孔培养板2中的传代小肠类器官去除培养基后，加入500微升预冷的无钙、镁离子磷酸盐缓冲溶液后置于冰上，用移液枪反复吹打每个孔的复合凝胶至破碎，得到复合凝胶悬液3；将复合凝胶悬液3转移至15毫升离心管8中，以200g转速和4℃温度下离心10分钟，去除离心管8中上清液；在离心管8中加入1毫升冻存液后，得小肠类器官重悬液；以2-3孔小肠类器官重悬液为一组，转移至一根2毫升冻存管中，放于含异丙醇的冻存盒中，-80℃放置24小时后放入液氮中长期保存，得到冻存小肠类器官；

步骤七、将存有小肠类器官重悬液的冻存管从液氮中取出，立即放入37℃水浴锅中速溶，待小肠类器官重悬液完全融化后，转移小肠类器官重悬液到15毫升离心管9中，加入预冷基础培养基至5毫升，在转速200g条件下离心10分钟；去除离心管9的上清液后，加入100微升复合凝胶液，得到小肠类器官复苏重悬液；将小肠类器官复苏重悬液按照每孔50微升体积接种于37℃预热24孔培养板3中；将24孔培养板3置于温度为37℃的二氧化碳培养箱中30分钟；待复合凝胶完全聚合后，再向24孔培养板3的每孔中加入500微升完全培养基，每3天更换一次完全培养基，得到复苏小肠类器官。