[发明专利]基于小鼠不同区段小肠的体外类器官3D培养、传代、冻存、复苏和鉴定方法

说明书

本发明公开了一种基于小鼠不同区段小肠的体外类器官3D培养、传代、冻存、复苏和鉴定方法。该方法包括：(1)对小鼠十二指肠、空肠和回肠区段的隐窝进行分离；(2)对小鼠十二指肠、空肠和回肠区段的隐窝进行3D培养，形成类器官；(3)小鼠小肠类器官传代；(4)小鼠小肠类器官冻存；(5)小鼠小肠类器官复苏；(6)小鼠小肠类器官冰冻切片制备；(7)小鼠小肠类器官冰冻切片免疫荧光标记及鉴定。相比于现有技术，本发明以含有干细胞的小肠隐窝为基础，优化了隐窝提取方式、体外培养体系和培养基，并包含完整的培养、传代、冻存、复苏和鉴定方法。此方法获得小肠类器官可以反复传代，且传代类器官具有性状稳定性。

技术领域

本发明涉及一种基于小鼠不同区段小肠的体外类器官3D培养、传代、冻存、复苏和鉴定方法。

背景技术

小肠作为人体最大的营养物质消化和吸收器官，由于其在代谢紊乱疾病如肥胖及糖尿病的重要作用，人们对肠道营养物质吸收、转运、感受和激素释放的兴趣日益增长。目前用于小肠营养物感受、转运、吸收及局部激素调节功能研究的体外模型主要分为两类：一类是以肠道组织为基础的模型，包括环法、外翻肠囊、尤斯灌流室和离体肠灌注，上述模型可以用于正常生理条件下微生物、上皮细胞、免疫细胞、神经细胞及其他细胞在组织中的相互作用；一类是以肿瘤细胞系为基础的模型，包括各种转化的肠道上皮细胞系，如Caco-2，HT29，NCI-H716，STC-1等，上述Caco-2细胞模型结合跨膜分析技术(Transwell)可以产生极化上皮层，用于体外上皮细胞反应研究。

但是，上述肠道功能体外研究模型均存在一定缺陷：肠道组织基础上的模型，因为上述模型需要获取离体组织，实验对象数量有限情况下将无法获得足够质量及数量的组织，而且离体组织具有时间有效性，因此只有有限的功能测试时间，实验的重复性及稳定性差。同时为了获取足够数据，动物使用量高。细胞基础上的模型，细胞组成单一，无法真正再现肠道细胞与细胞之间，细胞与细胞基质之间的相互作用。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于小鼠不同区段小肠的体外类器官3D培养、传代、冻存、复苏和鉴定方法。该方法区别于现有技术，优化了隐窝提取方式、体外培养体系和培养基，并包含了完整的培养、传代、冻存、复苏和鉴定等方法。进一步地，此培养方法获得小肠类器官可以反复传代，且传代类器官具有性状稳定性。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种基于小鼠不同区段小肠的体外类器官3D培养、传代、冻存、复苏方法，包括以下几个步骤：