[发明专利]一种通过合成生物学制备异烟肼烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法

权利要求书

1.一种通过合成生物学制备异烟肼烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法，包括步骤：

1).PCR扩增katG和inhA的DNA序列片段：

1-1).以SEQ ID №1所示的引物katGBglIIFP和SEQ ID №2所示的引物katGEcoRIRP，进行katG的PCR扩增；以SEQ ID №3所示的引物InhANcoIFP和SEQ ID №4所示的引物InhAHindШRP，进行inhA的PCR扩增；PCR扩增的目的DNA片段经核酸凝胶电泳后回收，-20℃保存备用；

2).构建pTrcHis2c-katG质粒：

2-1).扩大培养含有pTrcHis2c质粒的大肠杆菌DH5α菌株，抽提pTrcHis2c质粒；

2-2).将步骤1-1扩增后回收的katG序列片段和步骤2-1获得的pTrcHis2c质粒分别都使用BglⅡ和EcoRⅠ限制性内切酶进行双酶切；将酶切后回收的katG序列片段和线性化含有粘性末端的质粒pTrcHis2c使用T4 DNA连接酶16℃连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞并单克隆扩大培养，经抽提后获得pCDFDuet-katG质粒；

3).构建pET28a-inhA质粒：

3-1).扩大培养含有pET28a质粒的大肠杆菌DH5α菌株，抽提pET28a质粒；

3-2).将步骤1-1扩增后回收的inhA序列片段和步骤3-1获得的pET28a质粒分别都使用NcoI和HindⅢ限制性内切酶进行双酶切；将酶切后回收的inhA序列片段和线性化含有粘性末端的质粒pET28a使用T4 DNA连接酶16℃连接反应过夜，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞并单克隆扩大培养，经抽提后获得pET28a-inhA质粒；

4).纯化InhA蛋白：

4-1).将pTrcHis2c-katG质粒和pET28a-inhA质粒等量混合后共转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞单克隆扩大培养，控温16℃并添加0.5mM IPTG诱导蛋白表达，继续200rpm震荡培养2-3小时，然后加入100mg/mL的异烟肼和10mM的MnCl₂培养16小时；

4-2).离心收集菌体，缓冲液洗涤后重悬，再超声破碎后离心取上清液经结合缓冲液预平衡的Ni²⁺-NTA亲和层析柱，然后使用5个柱体积的第一洗脱缓冲液洗脱不能结合到层析柱上杂蛋白，进一步使用第二洗脱缓冲液洗脱并收集获得的目的InhA蛋白；所述第一洗脱缓冲液为50mM Tris-HCl，0.5M NaCl，80mM咪唑，pH 8.0；所述第二洗脱缓冲液为50mM Tris-HCl，0.5M NaCl，250mM咪唑，pH 8.0；

5).纯化INH-NAD化合物：

5-1).使用Millipore 10K超滤管浓缩纯化的InhA蛋白并使用pH 8.0的50mM Tris-HCl置换原有的洗脱液，将纯化的InhA蛋白浓缩换液至1mL，将浓缩液100℃加热50秒，然后离心收集上清，将获得的上清液添加到Millipore Microcon 3过滤柱中10000g 4℃离心1小时过滤除去蛋白，离心滤液即含有INH-NAD。

2.根据权利要求1所述的通过合成生物学制备异烟肼烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法，其特征在于：步骤2-1所述扩大培养是将大肠杆菌DH5α菌株接种于含有100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基37℃摇床200rpm震荡过夜培养；步骤2-2所述单克隆扩大培养是将大肠杆菌DH5α菌株涂布于含有100μg/mL氨苄青霉素的LB固体平板，平板放置37℃恒温培养箱培养过夜；挑取平板上长出的单克隆菌落接种于含有100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基37℃摇床200rpm震荡过夜培养。

3.根据权利要求1所述的通过合成生物学制备异烟肼烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法，其特征在于：步骤2-2单克隆扩大培养获得的质粒使用BglⅡ和EcoRⅠ限制性内切酶进行双酶切后经核酸凝胶电泳检测验证DNA片段katG连接到pTrcHis2c载体上获得质粒pTrcHis2c-katG。