[发明专利]一种通过合成生物学制备异烟肼烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法

说明书

本发明提供了一种通过合成生物学制备异烟肼烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法，包括步骤：1).PCR扩增katG和inhA的DNA序列片段；2).构建pTrcHis2c‑katG质粒；3).构建pET28a‑inhA质粒；4).纯化InhA蛋白；5).纯化INH‑NAD化合物。本发明的有益效果是：在大肠杆菌细胞内直接合成INH‑NAD并通过超滤管浓缩纯化和短时间加热后离心、过滤等步骤实现INH‑NAD的纯化分离。

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域。

背景技术

结核病(Tuberculosis，TB)是由结核分枝杆菌(结核菌)感染而引起的传染性疾病。结核病是困扰人类时间最长、危害最大的传染病之一。1882年，结核病的病原菌结核分枝杆菌才被德国科学家科赫分离并鉴定。在此之前，结核病在全球范围内多次发生大规模流行，并且被称为“白色瘟疫”。自五十年代以来，人类不断发现了有效的抗结核药物，使TB的流行得到了一定控制。抗结核药物是一把双刃剑，它既能够治疗TB，但是它也能够导致结核分枝杆菌出现对应的抗结核药物耐药株。

在今天全球TB的防控面临巨大的挑战，尤其是结核分枝杆菌和HIV(TB/HIV)共感染，耐多药(multidrug-resistant，MDR)和广泛耐药(extensively drug-resistant，XDR)结核病病例的出现。用于治疗结核病的药物通常分为一线药物和二线药物，目前常用的一线药物主要有异烟肼(INH)，利福平(RIF)，吡嗪酰胺(PZA)和乙胺丁醇(EMB)，一线药物疗效显著并能缩短整个治疗的周期。二线药物主要有：氨基糖苷类(aminoglycosides)：卡那霉素(kanamycin)和丁胺卡那霉素(amikacin)；环多肽类(polypeptides)：卷曲霉素(capreomycin)、紫霉素(viomycin)和恩维霉素(enviomycin)；氟喹诺酮类(fuoroquinolones)：氧氟沙星(ofoxacin)、加替沙星(gatifoxacin)和环丙沙星(ciprofloxacin)；环丝氨酸(D-cycloserine)；碳硫胺类(thionamides)：乙硫异烟胺(Ethionamide，ETH)和丙硫异烟胺(prothionamide)；PAS。二线药物毒性更大并且没有一线药物显著的疗效，主要用于MDR-TB的治疗以及延长治疗时间。异烟肼于1956年发现，是一种应用广泛的一线抗结核药物。该药物发挥抗结核活性首先需要蛋白KatG活化，活化后与NAD形成有活性的抗结核化合物异烟肼烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(INH-NAD)，该化合物结合到InhA蛋白中进而抑制其活性并最终影响结核菌细胞壁中分枝菌酸(Mycolic acid)的合成进而杀死结核菌(见下图)。异烟肼发挥抗结核活性必须是其活化后的化合物(INH-NAD)，临床分离耐药性结核菌中InhA蛋白通常会发生突变，从而导致INH-NAD不能结合到InhA蛋白上导致结核菌耐受INH作用。

发明内容

本发明的目的在于克服上述不足之处，提供一种在大肠杆菌细胞内直接合成INH-NAD并快速高效纯化分离该化合物的方法。

本发明所采取的技术方案是：

一种通过合成生物学制备异烟肼烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法，包括步骤：

1).PCR扩增katG和inhA的DNA序列片段：

1-1).以SEQ ID №1所示的引物katGBglIIFP和SEQ ID №2所示的引物katGEcoRIRP，进行katG的PCR扩增；以SEQ ID №3所示的引物InhANcoIFP和SEQ ID №4所示的引物InhAHindШRP，进行inhA的PCR扩增；PCR扩增的目的DNA片段经核酸凝胶电泳后回收，-20℃保存备用；

2).构建pTrcHis2c-katG质粒：

2-1).扩大培养含有pTrcHis2c质粒的大肠杆菌DH5α菌株，抽提pTrcHis2c质粒；