[发明专利]定向筛选土壤目标微生物菌群的方法

权利要求书

1.一种定向筛选土壤目标微生物菌群的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1采集土壤样品，制备土壤悬液：取土样，置于无菌瓶中，加入缓冲液，置于摇床上震荡，得土壤悬液，其中，所述缓冲液为含磷酸二氢钾的无菌磷酸缓冲液，pH 6.5；

S2分离培养：将步骤S1所述土壤悬液进行梯度稀释，取稀释液涂布到含有真菌抑制剂的培养基平板上，于培养箱内培养，然后，挑取单菌落在培养基平板上进行划线纯化，接着，挑取纯化后的所述单菌落，在含有无菌水的PCR管中搅拌，同时接种至含有液体培养基的离心管，再将离心管置于摇床上培养8h～12h生成菌株，PCR即聚合酶链式反应；其中，所述真菌抑制剂为放线菌酮和噻菌灵；

S3快速分筛：将步骤S2所述PCR管进行PCR反应；其中，所述PCR管中溶液作为后续PCR反应的模板，使用目标微生物的特异性引物进行PCR；采用琼脂糖凝胶电泳检测菌株的PCR扩增产物，筛选出扩增DNA片段大小与目标微生物扩增DNA片段相近的菌株，即为潜在目标微生物；其中，所述目标微生物为伯克氏菌或假单胞菌，所述伯克氏菌的特异性引物的序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，筛选出的扩增DNA片段大小为440bp；所述假单胞菌的特异性引物的序列分别如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示，筛选出的扩增DNA片段大小为250bp。

2.如权利要求1所述的定向筛选土壤目标微生物菌群的方法，其特征在于，步骤S1中，取土样5g～10g，置于无菌三角瓶中，所述缓冲液为45mL～90mL，含磷酸二氢钾1g/L，震荡时间为30min～60min，且每10min～15min以47kHz频率超声一次，每次20s～40s。

3.如权利要求1所述的定向筛选土壤目标微生物菌群的方法，其特征在于，步骤S2中，所述培养基为低营养培养基或富营养培养基，低营养培养基为1g/L磷酸二氢钾、0.1g/L硫酸铵、0.1g/L酵母提取物、20g/L琼脂，pH 6.5，富营养培养基为胰酪蛋白胨15.0g/L、大豆木瓜蛋白酶消化物5.0g/L、氯化钠5.0g/L、琼脂15.0g/L，pH 7.1～pH 7.5。

4.如权利要求1所述的定向筛选土壤目标微生物菌群的方法，其特征在于，步骤S2中，将步骤S1所述土壤悬液进行10倍梯度稀释，取稀释倍数为10、10²以及10³的稀释液分别涂布到真菌抑制剂的培养基平板上，所述放线菌酮和噻菌灵的浓度分别为100mg/L和50mg/L，于温度为30℃的培养箱内培养2～7天。

5.如权利要求1所述的定向筛选土壤目标微生物菌群的方法，其特征在于，步骤S2中，使用无菌牙签挑取单菌落在培养基平板上进行划线纯化，并使用无菌牙签挑取纯化后的所述单菌落，在含有20μL无菌水的PCR管中搅拌多次，同时接种至含有1mL液体培养基的2mL的离心管，将离心管置于转速为180rpm的摇床上培养8h～12h。

6.如权利要求1所述的定向筛选土壤目标微生物菌群的方法，其特征在于，在步骤S3中，所述PCR反应采用25μL反应体系：Takara Premix Ex Taq12.5μL，10μmol/L的引物各0.5μL，DNA模板1μL，无菌水10.5μL。

7.如权利要求1所述的定向筛选土壤目标微生物菌群的方法，其特征在于，在步骤S3中，PCR反应条件：95℃预变性30s，94℃变性60s，56℃退火30s，72℃延伸30s，32个循环，72℃延伸10min；或者，95℃预变性30s，95℃变性5s，60℃退火和延伸30s，32个循环，72℃延伸10min。