[发明专利]定向筛选土壤目标微生物菌群的方法

说明书

本发明公开了一种定向筛选土壤目标微生物菌群的方法，包括以下步骤：S1样品采集；S2分离培养；S3利用目标微生物特异性引物的聚合酶链式反应法快速分筛。本发明利用特异性引物和细菌菌液直接进行PCR快速筛选未知细菌菌群中的目标菌群，整个筛选过程操作简单，省时省力，快速、直观、高效，为环境样品中目标菌群的高通量筛选提供了一种快速便捷的方法。

技术领域

本发明涉及环境微生物技术领域，具体涉及一种定向筛选土壤目标微生物菌群的方法。

背景技术

土壤中存在着大量微生物，且种类繁多。微生物能够降解土壤环境中有机污染物，也可通过促进植物生长，提高植物修复的效率。由于外源添加到土壤中的微生物需要与土著微生物进行竞争，使得添加的微生物在土壤环境中存在时间较短。快速筛选土壤样品中的目标微生物菌群可有效提高污染土壤植物修复和微生物修复的效率。

目标微生物菌群的传统筛选主要采用选择性培养基法。由于选择性培养基的选择作用往往非常有限，分离得到的目标微生物菌群数量较少，尤其大量菌群没有合适的选择性培养基供使用。而且，传统分离过程成本高、周期长。

发明内容

针对以上不足之处，本发明的目的在于提供一种定向筛选土壤目标微生物菌群的方法，该方法可以在短时间内从大量未知细菌中识别目标微生物，实现土壤样品中的目标微生物菌群的定向高通量快速筛选。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种定向筛选土壤目标微生物菌群的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1采集土壤样品，制备土壤悬液：取土样，置于无菌瓶中，加入缓冲液，置于摇床上震荡，得土壤悬液；

S2分离培养：将步骤S1所述土壤悬液进行梯度稀释，取稀释液涂布到含有真菌抑制剂的培养基平板上，于培养箱内培养；然后，挑取单菌落在培养基平板上进行划线纯化；接着，挑取纯化后的所述单菌落，在含有无菌水的聚合酶链式反应(PCR)管中搅拌，同时接种至含有液体培养基的离心管；再将离心管置于摇床上培养8h～12h生成菌株；

S3快速分筛：将步骤S2所述PCR管置于PCR仪上，运行PCR程序；其中，所述PCR管中溶液作为后续PCR反应的模板，使用目标微生物的特异性引物进行聚合酶链式反应(PCR)；采用琼脂糖凝胶电泳检测菌株的聚合酶链式反应(PCR)扩增产物，筛选出扩增DNA片段大小与目标微生物扩增DNA片段相近的菌株，即为潜在目标微生物。

本发明，在步骤S1中，取5g～10g新鲜土样，置于无菌三角瓶中，加入45mL～90mL无菌磷酸缓冲液，置于摇床上震荡，得土壤悬液；其中，所述无菌磷酸缓冲液pH 6.5，含磷酸二氢钾1g/L；在置于摇床上震荡时，震荡时间为30min～60min，且每10min～15min以47kHz频率超声一次，每次20s～40s。

在步骤S2中，将步骤S1所述土壤悬液进行10倍梯度稀释，取稀释倍数为10、10²以及10³的稀释液分别涂布到含有真菌抑制剂的培养基平板上，于温度为30℃的培养箱内培养2～7天，其中，

所述真菌抑制剂为放线菌酮和噻菌灵，浓度分别为100mg/L和50mg/L；

所述培养基可以为低营养培养基，也可以为富营养培养基；进一步地，所述低营养培养基为1g/L磷酸二氢钾、0.1g/L硫酸铵、0.1g/L酵母提取物、20g/L琼脂，pH 6.5；所述富营养培养基为胰酪蛋白胨15.0g/L、大豆木瓜蛋白酶消化物5.0g/L、氯化钠5.0g/L、琼脂15.0g/L，pH 7.1～pH 7.5；

优选地，步骤S2中，使用无菌牙签挑取单菌落在培养基平板上进行划线纯化，接着，挑取纯化后的所述单菌落，在含有20μL无菌水的PCR管中搅拌多次，同时接种至含有1mL液体培养基的2mL的离心管，将离心管置于转速为180rpm的摇床上培养8h～12h。