[发明专利]一种降低水稻籽粒镉含量的育种方法

权利要求书

1.一种降低水稻籽粒镉含量的育种方法，其特征在于，采用CRISPR/Cas9技术定向敲除水稻OsNCX8基因，获得OsNCX8基因敲除的转基因植株，从中选择OsNCX8蛋白完全失活的纯合体植株，最终获得不带转基因成分、稻米镉含量降低的水稻植株；

包括如下步骤：

（1）克隆水稻受体材料的OsNCX8的外显子全长，测序；

（2）利用CRISPR/Cas9系统，根据OsNCX8的外显子序列选择靶标序列；

（3）构建含所述靶标序列片段的pCRISPR/Cas9重组载体；

（4）将所获得的pCRISPR/Cas9重组载体导入水稻愈伤组织中得到转基因苗；

（5）筛选所述转基因苗中的转基因阳性植株；

（6）利用所述转基因阳性植株获得突变植株；

（7）将所述突变体植株进行繁种，于后代植株中分离不含转基因成分的功能缺失的突变体，即为稻米镉含量降低的水稻；

其中，在步骤（1）中，OsNCX8的外显子序列如SEQ ID NO:1所示，用于克隆水稻受体材料的OsNCX8的外显子序列的上游引物序列为：F1：5’-ATGGCGCTCCTGCGCAGGCGG-3’，其为SEQID NO:2所示；用于克隆水稻受体材料的OsNCX8的外显子序列的下游引物序列为：R1：5’-CTATGCTGGCCACCAGGAGT-3’，其为SEQ ID NO:3所示；

其中，在步骤（2）中，所述的靶标序列如SEQ ID NO:4所示。

2.根据权利要求1所述的降低水稻籽粒镉含量的育种方法，其特征在于，所述步骤（3）具体包括以下步骤：

a. 根据靶标序列，设计带粘性末端的接头引物；

b. 将带粘性末端的接头引物退火互补形成带粘性末端的双链小片段；

c. 酶切包含sg-RNA的原始载体；

d. 将带粘性末端的双链小片段连接到酶切过的sg-RNA载体上，形成包含靶标序列和sg-RNA的重组载体；

e. 用LRmix将包含靶标序列和sg-RNA的重组载体和包含Cas9的载体进行LR反应重组，形成包含靶标序列-sg-RNA+ Cas9的完整的重组载体。

3.根据权利要求2所述的降低水稻籽粒镉含量的育种方法，其特征在于，在步骤a中，所述接头引物包括F2引物和R2引物，所述F2引物的序列如SEQ ID NO:5所示，所述R2引物的序列如SEQ ID NO:6所示。

4.根据权利要求2所述的降低水稻籽粒镉含量的育种方法，其特征在于，在步骤c中，采用BsaⅠ酶酶切包含sg-RNA的原始载体。

5.根据权利要求1所述的降低水稻籽粒镉含量的育种方法，其特征在于，在步骤（6）中，利用所述转基因阳性植株获得突变植株的具体步骤为：提取转基因阳性植株的DNA，设计特异性引物，扩增含靶标位点的DNA片段，对PCR扩增产物进行测序，选取OsNCX8开放阅读框发生移码突变提前终止或缺失起始密码子的纯合突变株系作为突变植株。

6.根据权利要求5所述的降低水稻籽粒镉含量的育种方法，其特征在于，所述特异性引物包括F3引物和R3引物，所述F3引物的序列如SEQ ID NO:7所示，所述R3引物的序列如SEQID NO:8所示。