[发明专利]一种降低水稻籽粒镉含量的育种方法

说明书

本发明公开了一种降低水稻籽粒镉含量的育种方法，采用CRISPER/Cas9技术定向敲除水稻OsNCX8基因，获得OsNCX8基因敲除的转基因植株，从中选择OsNCX8蛋白完全失活的纯合体植株，最终获得不带转基因成分、稻米镉含量降低的植株。OsNCX8蛋白是在水稻中鉴定到的第一个钠‑钙交换蛋白家族成员，使OsNCX8蛋白失活以后导致籽粒镉含量降低45％左右。而且OsNCX8蛋白失活的植株农艺学性状和正常植株相比没有明显改变。在T₀代植株中就可以得到OsNCX8蛋白完全失活的纯合体植株，大大缩短育种时间，并且在其后代中可以筛选到不含转基因成分的植株，规避了转基因带来的安全隐患。

技术领域

本发明涉及植物生态学和农业技术领域，特别是指一种降低水稻籽粒镉含量的育种方法。

背景技术

水稻是我国主要的粮食作物之一，随着工农业的发展，环境和土壤中的重金属，特别是重金属镉，在水稻各个组织积累，影响水稻的产量和品质。镉在环境中不能降解，可通过食物链严重危害人类的健康。目前，湖南省水稻重金属污染严重，尤其是籽粒(大米)中重金属镉含量超标威胁人类健康，降低籽粒中的镉含量非常重要。通过换土、优化水肥或者全生育期淹水等措施都可以缓解镉对水稻的毒害，降低稻米中的镉含量，但这会大大增加种植成本。因此，从遗传上改良水稻品种的耐镉性，选育镉积累量低的品种，是减少稻米镉污染的一个经济且有效的途径。

水稻自然突变为水稻育种提供了重要材料，如掀起第二次绿色革命的水稻半矮杆基因sd-1，但是自然突变的突变效率极低，且需要常规的杂交、回交进行分离鉴定，工作量大且不足。随着技术的发展，出现了化学方法和物理方法诱导人工突变，大大提高了突变效率，但是产生的多位点突变增加了表型鉴定的难度。随后出现的基因工程方法诱导突变成了最主要的获得水稻突变体的方法。但是这些方法获得的突变体是随机的，不可控的，不能对特定基因进行沉默，不能对特定的位点进行突变，而且不能实现基因敲除的突变体，因此基因编辑技术对水稻生产实践意义重大。

从生物学原理上讲，基因编辑技术的基因定点突变与传统的基因随机突变(自然突变或人工诱变)的性质具有实质等同性，但是基因编辑定点突变更具有针对性和效率性。基因编辑技术可以在后代突变株系中筛选出包含靶基因突变，并且无选择标记基因的突变株系。因此基因编辑技术应当比传统的诱变育种方法具有更高的安全性，使得改造后的作物更为稳定、安全。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提出一种降低水稻籽粒镉含量的育种方法，本发明的育种方法通过CRISPER-Cas9基因敲除技术定向敲除水稻OsNCX8，彻底失活钙离子转运蛋白OsNCX8，定向育成不带转基因成分，稻米镉含量显著降低，综合性状无显著变异的水稻材料。

基于上述目的，本发明提供的一种降低水稻籽粒镉含量的育种方法，采用CRISPER/Cas9技术定向敲除水稻OsNCX8基因，获得OsNCX8基因敲除的转基因植株，从中选择OsNCX8蛋白完全失活的纯合体植株，最终获得不带转基因成分、稻米镉含量降低的水稻植株。

目前并没有发现钙离子转运蛋白参与镉的运输，OsNCX8是水稻中鉴定到的第一个钠-钙交换蛋白家族成员，推测编码一个Na/Ca交换运输蛋白，参与水稻中镉的运输和积累，使OsNCX8蛋白失活以后导致稻米镉含量降低。

在本发明的一些实施例中，降低水稻籽粒镉含量的育种方法包括如下步骤：

(1)克隆水稻受体材料的OsNCX8的外显子全长，测序；

(2)利用CRISPER/Cas9系统，根据OsNCX8的外显子序列选择靶标序列；

(3)构建含所述靶标序列片段的pCRISPER/Cas9重组载体；

(4)将所获得的pCRISPER/Cas9重组载体导入水稻愈伤组织中得到转基因苗；

(5)筛选所述转基因苗中的转基因阳性植株；