[发明专利]检测马铃薯M病毒用的引物、试剂盒及方法

权利要求书

1.一种检测马铃薯M病毒用的引物，其特征在于包括：

PVM-F3:5’-TATGAGGACCGGTTCGCC-3’

PVM-B3:5’-GACCATTCATACCGCCAGTC-3’

PVM-FIP:5’-CGGGGTTGGTCGCCTTATCAG-TTACGTGGAGAACACTGCTG-3’

PVM-BIP:5’-AAGGACGTGGCTTTACGTGGT-ACCTCGGCATTAAGAGAGCT-3’。

2.一种检测马铃薯M病毒用的试剂盒，其特征在于该试剂盒包括有：

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于所述的2×反应液缓冲液由以下组分组成：

4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于所述的酶溶液为Bst DNA聚合酶和AMV逆转录酶混合液。

5.根据权利要求2至4所述的任一种试剂盒，其特征在于荧光目视检测试剂中含有钙黄绿素荧光染料。

6.一种马铃薯M病毒检测方法，其特征在于包括以下步骤：

A、植物组织总DNA提取；

B、LAMP检测：

采用权利要求2所述的试剂盒配置预反应溶液，在预反应溶液中分别加入待检测的样品的DNA 5μL，使总量达到25μL；其中对照组在预反应溶液加入去离子水5μL；阳性对照在预反应溶液中加入带病毒的DNA 5μL；用移液器吸排液法混合，或者合上盖子轻击使溶液充分混合后瞬时离心，混合时避免产生气泡；将混合物置于反应孔中，于65℃恒温反应90min，最后80℃下保温5min以结束反应；

C、LAMP结果判断

扩增反应结束后，使用紫外线照射装置，波长240-260nm，350-370nm，从反应试管底部向上进行紫外线照射，佩戴眼镜等防护用具后从反应试管侧面进行观察，若与阳性对照一样发出绿色荧光，则判定为阳性即样品中带有马铃薯M病毒；若与阴性对照一样未发出绿色荧光，则判定样品中没有携带马铃薯M病毒。

7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于步骤A中植物组织总DNA提取的具体步骤：

a制样：取0.5g的带毒组织加入1mL抽提缓冲液进行研磨；

b清洗纳米磁珠：取出免疫纳米磁珠到PCR管中，用ddH₂O反复清洗纳米磁珠3次，在磁铁的作用下吸去ddH₂O；

c结合：加入100μL的样品到PCR管中，用移液枪吸吐混匀样品和纳米磁珠，室温下吸附；

d清洗：在磁铁的作用下移去上清，纳米磁珠清洗3次；

e裂解：加入50μL ddH2O到PCR管中,用移液枪吸吐混匀纳米磁珠后，95℃，10min；

f取样：用磁铁吸附纳米磁珠，待PCR管内溶液澄清后，上清即为病毒RNA；

g核酸浓度的测定

取5μL DNA溶液加ddH₂O梯度稀释至1mL，使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计测260nm和280nm处的光密度值；RNA的浓度按照以下公式计算获得：

RNA C＝40×N×A

式中：

C——RNA浓度(ng/μL)

A——260nm处的吸光值

N——核酸稀释倍数

1OD_260nm＝40μg/mL单链RNA

当OD₂₆₀/OD₂₈₀比值在1.7～1.9之间时，适宜于PCR扩增和LAMP检测。

8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于所述纳米磁珠通过以下方法制备：

1)Fe₃O₄磁性纳米粒子制备与氨基化修饰

分别取5.2g FeCl₃·6H₂O、2.7g FeSO₄·7H₂O、0.85mL 12.1moL/L的浓盐酸溶解于200mL水中，超声脱氧，后将以上溶液滴入250mL、0.75moL/L NaOH溶液；所有反应在80℃下搅拌，随着反应的进行，反应液中出现黑色的沉淀，反应结束后，利用磁分离器将所得沉淀从反应介质中分离出来，再用去离子水清洗3次，无水乙醇清洗2次，并配成5g/mL的Fe₃O₄磁性纳米粒子无水乙醇溶液，取25mL Fe₃O₄磁性纳米粒子无水乙醇溶液，再用无水乙醇稀释到150mL，超声振荡30min，滴加0.4mL APTES，其中硅烷偶联剂：3-氨基丙基三乙氧基硅烷，室温下搅拌7h，反应完毕，用磁分离器将APTES修饰的Fe₃O₄磁性纳米粒子从反应介质中分离，并用无水乙醇溶液清洗3次，最后配成10.5mg/mL的氨基化Fe₃O₄纳米磁珠无水乙醇溶液；

2)免疫磁珠的制备

取0.5mL氨基化Fe₃O₄纳米磁珠无水乙醇溶液，用1mL PBS清洗3次，磁分离器弃上清液，加入5％(V/V)戊二醛溶液2mL，室温振荡交联2h，磁分离，弃上清液，用PBS洗涤3次并弃上清液后，分别采用0.5mL不同稀释倍数的相应病毒抗体包被氨基化Fe₃O₄纳米粒子，室温下振荡固定2h，磁分离，用PBS和超纯水分别洗涤3次，再用PBS定容，4℃冰箱保存备用，到具有最佳吸附量的一病毒抗体免疫磁珠。