[发明专利]一种萌发初期的羊草种子RNA提取方法

权利要求书

1.一种萌发初期的羊草种子RNA提取方法，其特征在于：所述羊草种子RNA提取方法选用提取缓冲液A将含有多聚聚乙烯比咯烷酮PVPP的羊草种子冻干粉溶解，加入聚乙烯吡咯烷酮PVP、乙基苯基聚乙二醇NP-40和蛋白酶K，经水饱和酚+氯仿+异戊醇抽提，用Trizol提取方法再次抽提，最终得到高质量、高纯度的羊草种子RNA。

2.根据权利要求1所述的一种萌发初期的羊草种子RNA提取方法，其特征在于：所述羊草种子RNA提取方法的具体操作步骤如下：

(1)取0.5g萌发三天时的羊草种子放入加有液氮的研钵中，加入0.05gPVPP，迅速研磨成粉；

(2)将含有PVPP的冻干粉末混匀，加入到2ml干净的离心管至0.5ml处，加入500μl提取缓冲液A，旋涡振荡混匀30s，加入质量浓度为2％的PVP、10μl NP-40和50μl质量浓度为20mg/ml的蛋白酶K，旋涡振荡2min，置于42℃摇床中以150r/min的速度摇动30min；

(3)加入0.5ml预冷的水饱和酚+氯仿+异戊醇，水饱和酚∶氯仿∶异戊醇＝49∶49∶2，颠倒振荡3～5min，使两项充分混合，在室温条件下静置5min，4℃、12000g离心5min；

(4)使用Trizol提取方法抽提：取0.5ml上清液至2ml新的干净离心管中，加入1ml的Trizol提取液B，加入质量浓度为1％的β-巯基乙醇，旋涡振荡1min，加入0.2ml氯仿，颠倒振荡3min，4℃、12000g离心5min；

(5)取1ml上清液至新的干净离心管中，加入1ml预冷的异丙醇，在室温条件下放置15min，4℃、12000g离心15min；

(6)小心弃去上清液，加入1ml预冷的质量浓度为75％的乙醇，轻轻颠倒摇动以悬浮洗涤沉淀，冰上放置2min，4℃、10000g离心5min；

(7)重复上述(6)步骤；将空管4℃、10000g离心2min，小心的吸干余液，在室温条件下干燥3～5min，加入50ul RNase-free ddH₂O溶解沉淀即得羊草种子RNA。

3.根据权利要求2所述的一种萌发初期的羊草种子RNA提取方法，其特征在于：所述步骤(2)中的提取缓冲液A的配制，如配制10ml提取缓冲液A：包括7ml RNase-free ddH₂O、0.5ml摩尔浓度为1mol/L、pH＝9的Tris、1ml摩尔浓度为2mol/L的NaCl、1ml质量浓度为10％的十二烷基硫酸钠SDS、0.4ml摩尔浓度为0.5mol/L的乙二胺四乙酸EDTA、1ml摩尔浓度为1mol/L的二硫苏糖DTT。

4.根据权利要求2所述的一种萌发初期的羊草种子RNA提取方法，其特征在于：所述步骤(4)中Trizol提取液B的配制体系，如配制100ml的Trizol提取液B：包括47.27g摩尔浓度为4mol/L的异硫氰酸胍、0.681g摩尔浓度为0.05mol/L的NaAc·3H₂O、5.83g摩尔浓度为1mol/L的NaCl、0.5g质量浓度为5％的SDS、0.745g摩尔浓度为0.02mol/L的EDTA·2H₂O，由RNase-free ddH₂O溶解后，加入等体积的水饱和酚，用冰醋酸调节pH值在4.2～4.3之间。

5.根据权利要求2所述的一种萌发初期的羊草种子RNA提取方法，其特征在于：所述步骤(6)中质量浓度为75％的乙醇由无水乙醇和RNase-free ddH₂O配制，所述RNase-freeddH₂O是经过焦碳酸二乙醇DEPC处理的高温高压灭菌的超纯水。