[发明专利]一种萌发初期的羊草种子RNA提取方法

说明书

本发明公开了一种萌发初期的羊草种子RNA提取方法，该提取方法选用提取缓冲液A将含有PVPP的羊草种子冻干粉溶解，加入PVP、NP‑40和蛋白酶K，经水饱和酚+氯仿+异戊醇抽提，用Trizol提取方法再次抽提，最终得到高质量、高纯度的羊草种子RNA。本发明较好的去除了淀粉和蛋白质对RNA提取的干扰，使得试管中的溶液分层清晰明显，提取过程方便，DTT、PVPP、PVP和β‑巯基乙醇以及Trizol提取液B中的高浓度Na⁺有利于去除多糖物质和酚类物质对RNA的干扰，减少抽提的次数，减少了RNA在操作过程中的损失。本发明具有高效率、高质量、低成本和周期短等优点，提取的RNA可以直接用于分子生物学研究。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体的说是涉及一种萌发初期的羊草种子RNA提取方法。

背景技术

RNA是生物体内的重要遗传物质，随着分子生物学技术的快速发展，RNA成为分子克隆最重要的模板材料，RNA的提取质量对于分子生物学领域的研究显得极为重要。RNA提取的完整性和纯度是衡量RNA质量的两个关键指标。高纯度和完整性好的高质量RNA对于分子克隆、cDNA文库构建和高通量测序等后续研究和分析的客观性和准确性极为重要。尽管目前RNA提取的技术已经很成熟，提取的方法多种多样，但在不同的物种之间由于物种组织结构和内含物质的特异性，RNA的提取质量差异很大。究其原因主要是提取方法的适宜性、试剂耗材的处理、人的操作、组织材料的选择和保存等因素。其中提取方法的适宜性和组织材料关系密切。不同的组织材料含有的多糖、脂质、色素类物质、淀粉、蛋白质和酚类物质等不同。在植物种子中，淀粉、多糖、蛋白质、脂质和酚类等次生物质丰富，这些物质对于RNA的提取有不利影响。因此，简单的选择一种市面上常用的提取试剂盒难以达到预期的实验目的，而且众多的RNA提取试剂盒也不同程度的存在一些缺陷，对于一些特殊的组织材料提取效率低，提取的总RNA质量较差。为此，针对特定的组织材料需要制定适宜的提取方法。

羊草又称碱草(Leymus chinensis)，是禾本科赖草属多年生根茎型禾草，是我国草甸草原和典型草原的优势种之一，素有“牧草中的细粮”之称。在当前发展草地畜牧业、改善西部生态环境等方面具有重要地位。然而羊草有性繁殖能力低，种子休眠严重，发芽率低，当年采集的种子发芽率仅为10％～20％，严重影响了羊草栽培草地的建设和退化草原的补播恢复。为了培育高产、优质、适应性好的羊草新品种，利用分子生物学手段研究和改良羊草种质资源有着重要意义。

然而，羊草的干种子在萌发的初期(萌发3天)所含的淀粉、脂质、蛋白质、多糖和种皮色素等物质较多，严重影响了RNA的提取。采用常规的植物RNA提取试剂盒Trizol等方法难以提取出高质量的羊草萌发初期种子RNA。相对于水稻、小麦等禾本科植物，羊草种子较小、种皮较厚、单位质量粒数多，因此，用类似现有技术中的水稻(申请号201410379838)、小麦种子或种胚RNA的提取方法，难以满足羊草种子高通量转录组测序的要求。在高通量转录组分析中，单位质量的粒数越多，个体间差异的特异性稀释的越小，一些重要的差异基因在分析中可能筛出而丢失重要的信息，此外个体小、粒数多会积累大量的表皮色素物质，对于RNA后续的检测和纯化影响较大。因此，尽可能提高RNA提取的效率，减少RNA的损失有助于羊草种子RNA的分子生物学实验。

在羊草种子中，现有技术中通常采用的RNA提取方法常常难以达到实验要求，常见的问题是提取纯度低、质量少，小量种子提取更加困难。在提取过程中影响提取质量的主要原因是干种子中游离的RNA较少；种子中淀粉含量和蛋白含量很高，大部分RNA产物被淀粉和蛋白结合，在洗涤、纯化过程中流失；色素影响RNA的质量。

发明内容

本发明为了克服现有技术存在的不足，我们发明了一种高效、优质的提取羊草萌发初期种子RNA的方法，以期为羊草分子生物学的研究奠定重要的工作基础，并为羊草种子RNA的提取和下游实验提供条件。