[发明专利]红细胞膜表面修饰基因递送系统及制备方法及应用

说明书

本发明公开了红细胞膜表面修饰基因递送系统及制备方法及应用，制备：一.取血液，移除血浆和白细胞层，得样品1；清洗，加入0.25×PBS缓冲溶液，冰浴放置，使红细胞膜破裂并释放血红素，离心，收集样品2；清洗，离心，得样品3，加入到PBS缓冲溶液中，超声，得样品4；通过脂质体挤出器来回挤压过纳米聚碳酸酯薄膜，反复进行，收集红细胞膜囊泡液为样品5；超声，得纳米红细胞膜液为样品6；二.基因复合物的制备；三.将样品6滴加到基因复合物中,得红细胞膜表面修饰基因递送系统。本发明的系统，转染效率高，细胞毒性低。生物相容性好，在血液中稳定，避免了其在体内很快被清除，在体内循环时间大大延长，有利于基因递送与表达。

技术领域

本发明属于分子生物领域，涉及一种红细胞膜表面修饰基因递送系统及其应用。

背景技术

随着红细胞载体的研究越来越广泛，作为自体细胞，红细胞载体具有很多独特的优势。它是血液中数量最多且寿命最长的细胞，具有极高的生物相容性，在体内循环时间能够长达120天，并且能够完全降解。因此，被广泛的用于药物载体，进行疾病的治疗。但是，红细胞直接包载药物也存在一些缺陷，如药物漏出，难以标准化制备等，这些都限制了其应用。因此，研究者们分离出纯净的红细胞膜，既保留了红细胞的优势，又易于制备，广泛应用于纳米药物递送系统。但是，红细胞膜很少用于基因递送系统，进行基因治疗。

目前，基因治疗的关键是安全高效的基因递送系统的构建与制备，如何获得安全高效的基因递送系统是非常重要的研究内容。病毒递送系统转染效果很好，但是因其安全问题备受争议。近年来，阳离子聚合物递送系统因其易于制备修饰、高转染效率等特点，受到了人们广泛的关注。但是由于其较高的电荷密度，在具有高的细胞转染效率的同时也具有很高的细胞毒性。并且，由于其正电荷的表面，这种递送系统在血液中很不稳定，且易被清除，在血液中循环时间很短，达不到满意的基因治疗效果。因此，安全高效稳定且具有血液长循环特点的基因递送系统的设计仍面临着很大的挑战。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种具有很好的生物相容性、在血液中长时间循环及高效基因递送效果的红细胞膜表面修饰基因递送系统。

本发明的第二个目的是提供红细胞膜表面修饰基因递送系统的制备方法。

本发明的第三个目的是提供红细胞膜表面修饰基因递送系统在制备基因递送药物的应用。

本发明的技术方案概述如下：

红细胞膜表面修饰基因递送系统的制备方法，包括如下步骤：

一.纳米红细胞膜液的制备：

(1)按比例，取375微升血液，加入EDTA，阻止其凝血，在600-1000g转速、4℃条件下离心5-10分钟，移除血浆和白细胞层，得到样品1；

所述EDTA和所述血液比例为1.5毫克/毫升；

(2)样品1用1×PBS缓冲溶液清洗至少5次，加入相当于所述血液体积8-20倍的0.25×PBS缓冲溶液，冰浴条件下，放置30-60分钟，使红细胞膜破裂并释放血红素，在4000-5000g转速下离心10-15分钟，收集浅粉色物为样品2；

(3)样品2用1×PBS清洗至少5次，离心，得到样品3，加入到8毫升pH＝7.4的PBS缓冲溶液中，超声1-2小时，得到样品4；

(4)将样品4通过脂质体挤出器来回挤压过200-800纳米的聚碳酸酯薄膜，反复进行至少10次，收集红细胞膜囊泡液为样品5；

(5)将样品5超声1-2小时，得纳米红细胞膜液为样品6，备用；

二.基因复合物的制备：