[发明专利]G蛋白偶联受体87促进JAK/STAT3信号传导的方法

权利要求书

1.一种G蛋白偶联受体87在胰癌中促进JAK/STAT3信号传导的方法，其特征在于，所述G蛋白偶联受体87在胰腺导管腺癌中促进JAK/STAT3信号传导的方法包括以下步骤：

步骤一，细胞培养；

步骤二，组织标本；

贵州医科大学附属医院提供了2000年至2006年期间收集的121个石蜡包埋的PDA封存标本；样品获自手术切除的肿瘤患者的临床和组织病理学诊断与PDA，并通过病理学检查证实；

步骤三，蛋白质印迹分析；

使用抗GPR87进行蛋白质印迹分析：抗-pSTAT3，抗STAT3，抗pJAK2，抗JAK2，抗pTyr-100；抗Flag和抗HA抗体；将膜剥离并用抗-α-肌动蛋白或抗GAPDH抗体重新检测上样对照；

步骤四，微阵列数据处理和可视化；

从GEO数据库下载微阵列数据；微阵列数据提取在MeV 4.6；GSEA使用GSEA2.0.9进行；

步骤五，质粒产生；

进行人类GPR87基因的PCR扩增，并将cDNA克隆到pSin EF2慢病毒载体中以表达重组FLAG-标记的GPR87；截短的JAK2片段也被克隆到pSin EF2中；将靶向GPR87和JAK2的shRNA克隆到pSuper Retro病毒载体中；为了产生萤光素酶报告基因，将3×STAT3应答元件克隆到pTAL Luc载体中；所有在质粒构建中使用的寡核苷酸列于补充方法的寡核苷酸表中；

步骤六，免疫沉淀；

用含有150mM NaCl，10mM HEPES，pH7.4和1％NP-40的缓冲液裂解用指定质粒转染的总共3×107个BXPC-3细胞；然后将裂解物与FLAG亲和琼脂糖在4℃下温育过夜；用免疫沉淀洗涤缓冲液(150mM NaCl，10mM HEPES，pH 7.4,0.1％NP-40)洗涤含有亲和结合蛋白的珠子7次，用2×200μL1M甘氨酸(pH3.0)洗脱；样品变性，然后通过SDS-PAGE分辨；

步骤七，球体形成；

将5×102个细胞接种在6孔超低簇板中，将10或20个细胞接种在24孔超低簇板中；将细胞在补充有2％B27(Invitrogen)，20ng/mL EGF，20ng/mL bFGF(PeproTech)，0.4％BSA(Sigma-Aldrich)的DMEM/F12无血清培养基(Invitrogen)中培养10天，和5μg/mL胰岛素用于球形成；

步骤八，流式细胞术分析；

将细胞用胰蛋白酶消化并以1×10⁶个细胞/mL的浓度重悬于含有2％FBS的DMEM中；然后将细胞在存在或不存在100μM维拉帕米(Sigma-Aldrich)的条件下于37℃预温育30分钟以抑制ABC转运蛋白；随后，将细胞与5μg/mL Hoechst 33342(Sigma-Aldrich)在37℃孵育90分钟；随后在冰上孵育10分钟并在流式细胞术分析之前用冰冷的PBS洗涤；使用Summit 5.2软件(Beckman Coulter)分析数据；

步骤九，肿瘤异种移植物；

所有的实验程序均由中山大学的IACUC批准；将裸鼠随机分为六组(每组n＝5)；将指定数目的细胞皮下接种到裸鼠中；接种后31天处死小鼠，切除肿瘤并进行病理学检查；

步骤十，EMSA实验；

使用来自Pierce Biotechnology的LightShift化学发光EMSA试剂盒进行EMSA；使用含有特异性结合位点的以下DNA探针：STAT3：有义，5'-TCGACATTTCCCGTAAATC-3'，反义，5'-GATTTACGGGAAATGTCGA-3'；和OCT-1：有义，5'-TGTCGAATGCAAATCACTAGAA-3'，反义，5'-TTCTAGTGATTTGCATTCGACA-3'；

步骤十一，统计分析。