[发明专利]一种利用植物激素GA及小分子物质PAC调节细胞通路的方法

权利要求书

1.一种利用植物激素GA及小分子物质PAC调节细胞通路的方法，其特征在于：采用以下引物：

GID1-F：GCGTGGTACCTCTAGAATGGCTGCGAGCGATGAAGT，

GID1-R：GAAGCGGCCGCCCGGGTTAACATTCCGCGTTTACAA；

GID1-F：GCGTGGTACCTCTAGAATGGCTGCGAGCGATGAAGT，

GID1-LRP6C-R：CCCGAGCCACCGCCGGAACCGCCACCTTAACATTCCGCGTTTACAA；

LRP6C-F：GGCGGTGGCTCGGGAGGTGGCTCAAGGATGTTGTGTCCACGTAT，

LRP6C-R：GAAGCGGCCGCCCGGGTCAGGAGGAGTCTGTACAGG；

GAI-F：GCGTGGTACCTCTAGAATGAAGAGAGATCATCATCA，

GAI-R：GAAGCGGCCGCCCGGGATTGGTGGAGAGTTTCCAAG；

GAI-F：GCGTGGTACCTCTAGAATGAAGAGAGATCATCATCA，

GAI-LRP6C-R：CCCGAGCCACCGCCGGAACCGCCACCATTGGTGGAGAGTTTCCAAG；

LRP6C-F：GGCGGTGGCTCGGGAGGTGGCTCAAGGATGTTGTGTCCACGTAT，

LRP6C-R：GAAGCGGCCGCCCGGGTCAGGAGGAGTCTGTACAGG；

包括以下步骤：

（1）载体设计以及构建：

首先利用所述的引物，以拟南芥和HEK293T细胞反转录的cDNA为模板，利用pcr技术将各基因片段扩增出来，然后利用对应引物，用两段片段为模板，进行overlap PCR，将拟南芥DELLA蛋白GAI及GA受体GID1与Wnt信号通路内的关键蛋白质LRP6的C端，融合到一起，利用琼脂糖凝胶回收PCR产物GAI、GID1、GAI-LRP6C、GID1-LRP6C，用内切酶XbaI XmaI双酶切线性化的pCI 4xmyc、pCI egfp以及pCI mcherry载体，利用Infusion的方法连接，转化DH5a，菌落pcr验证，挑取克隆送测序，测序正确的保菌；利用以上操作，构建获得动物表达载体pCI-neo egfp GAI、 pCI-neo 4xMYC GID，pCI-neo mcherry GID-LRP6C，pCI-neo 4xMYCGID-LRP6C，pCI-neo egfp GAI-LRP6C；

（2）动物细胞的培养以及转染：

将冻存的HEK293T细胞从液氮中取出，37℃水浴迅速复苏细胞，接着放入离心机，800g离心5min，弃上清，加入1ml DMEM高糖细胞培养液重悬细胞，将细胞悬液加入含有预热过的10mlDMEM培养基的细胞培养瓶中，24h后更换培养基，待细胞的生长率到90%，将细胞重悬并且转移至6孔板内，转移24h后，进行磷酸钙法细胞转染，在六孔板每孔转染pCI-neo egfpGAI、 pCI-neo 4xMYC GID两种质粒或者pCI-neo 4xMYC GID-LRP6C、pCI-neo egfp GAI-LRP6C两种质粒各2微克；

（3）GA以及PAC的给药

转染24h后，加入终浓度为10μM的GA，和细胞在37℃，5%CO₂中共同孵育12h，再加入终浓度为100nM的抑制剂PAC，孵育3h；孵育完成后，重悬细胞，利用细胞裂解液裂解，利用Western进行检测。