[发明专利]一种利用植物激素GA及小分子物质PAC调节细胞通路的方法

说明书

本发明提供了一种利用植物激素GA及小分子物质PAC调节细胞通路的方法，实现了人细胞内信号通路的调控开关。将拟南芥内GA受体蛋白GID1及GAI构建在人细胞表达载体上，然后一起转入HEK293T细胞，加入GA，诱导两个蛋白相互作用，加入抑制剂PAC后，互作程度会减弱。利用这种方式，将人细胞信号通路中的关键蛋白与这两个受体蛋白融合表达，两个受体蛋白在GA诱导下互作，导致融合的信号通路也受GA的诱导。本发明选择了人Wnt通路上的关键蛋白LRP6。融合表达GA受体以及LRP6以后，LRP6会在GA诱导下聚集，进而促进β‑连环蛋白的产生，打开细胞内的信号通路，加入PAC抑制后，β‑连环蛋白产生量减少，细胞通路关闭。

技术领域

本发明涉及生物方法发明领域，具体的说，是一种利用植物激素GA以及小分子物质PAC调节细胞通路的方法。

背景技术

光遗传学是一种将光控技术与遗传学相结合以进行细胞生物学研究的新技术，即将光敏感的离子通道蛋白表达于可兴奋的靶细胞或靶器官上，利用相应波长的光照激活光敏感通道以实现对细胞、组织、器官及动物生理功能的精细调控，到目前为止，许多光受体被改良，用于融合信号通路上的关键蛋白，来调控和控制生物体内的众多通路，如受体酪氨酸激酶Ras-MAPK信号通路、PI3K-Akt信号通路和Wnt信号通路。在基因水平上, 研究者利用CRY2-CIB1、FKF1-GI、UVR8-COP1和LOV蛋白等元件来调控哺乳动物细胞中特定基因的转录表达。有研究将拟南芥蓝光受体CRY2与Wnt信号通路内的LRP6蛋白融合表达，实验证明，蓝光诱导下CRY2的聚集同样使融合表达的LRP6发生聚集作用。从而调控了下游β-catenin信号通路。

麻省理工大学的张峰实验室利用免疫抑制因子雷帕霉素（Rapamycin）控制其受体蛋白并与dCas9构成了一个转录激活系统。张峰将受体蛋白FKBP与dCas9的C端以及转录激活子VP64融合表达；FRB与dCas9的N端融合表达。将这两个载体以及sgRNA共同转入细胞内，雷帕霉素处理后，靶基因的转录被激活。然而，此方法和光遗传学都有一定限制。雷帕霉素是免疫抑制子，对免疫系统有一定伤害；光遗传学的系统不适合于细胞内的光信号通路的调控。

受到光遗传学（optogenetics）中利用光受体进而调控相关细胞信号通路的启发，我们设想利用化学小分子物质植物激素GA来诱导受体蛋白的互作，从而来调控细胞信号转导。

赤霉素（Gibberellic Acid，GA）作为植物激素的地位是在20世纪50年代确立的。GA的典型生理作用就是显著地促进植物茎节的伸长生长，并在从种子萌发到开花结果等植物的各种生理活动中扮演重要的角色。GA是一种双萜酸化合物，无毒性，对人的健康不会造成任何危害。相反曾有报道说服用适量的赤霉素可以治疗胃溃疡，胃粘膜受损等疾病。GA信号通路依赖传导需要受体蛋白GID1（GA INSENSITIVE DWARF1），GA结合GID1促进GID1N端构像的变化，GA-GID1复合物可以结合GA信号抑制子DELLA蛋白家族。促进DELLA蛋白被26s蛋白酶体降解从而激活GA的信号通路。GAI就是DELLA蛋白的其中一员。多效唑(Paclobutrazol)PAC是一种植物生长的抑制剂，PAC可以通过抑制GA的生物活性对GA产生拮抗作用。

利用GA诱导GID1与GAI蛋白互作，PAC抑制这个过程的特性，以及光遗传学的原理，我们试着研发一种以无毒害的天然植物激素为诱导剂，调控细胞内信号通路的系统。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用植物激素GA以及小分子物质PAC调节细胞通路的方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种利用植物激素GA以及小分子物质PAC调节细胞通路的方法，包括以下方法：

（1）载体设计以及构建：