[发明专利]一种降低抗体核心岩藻糖基化的方法和组合物

说明书

本发明提供了用于制造具有复杂的N‑连接聚糖但核心岩藻糖基化降低的重组抗体的小分子甘露糖类似物，甘露糖类似物通常被宿主细胞摄取(例如，通过主动运输或被动扩散)，抑制产生GDP岩藻糖。本发明提供的方法由于合成底物采用甘露糖，价格极低；并且使用该方法降低核心岩藻糖基化的同时，不会对N‑连接聚糖的高甘露糖糖型比例产生影响。

技术领域

本发明涉及一种降低抗体的核心岩藻糖基化的方法和使用的化合物技术领域。

背景技术

重组治疗蛋白是通过许多不同方法生产的。一种优选方法是从哺乳动物宿主细胞系生产重组蛋白。工程改造了诸如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞之类的细胞系来表达感兴趣的治疗蛋白质。不同细胞系在重组蛋白时的优缺点各有不同，包括蛋白质特征和产率。单克隆抗体或抗体衍生物就是重组蛋白的一种，在选择生产细胞时需要平衡考虑对高产率和产品一致性。

Fc片段通过活性区域与受体相结合发挥效应子功能。IgG的N-糖基化位于Fc片段的CH2区的共有序列(Asn297-X-Ser/Thr，X可以是除脯氨酸的任意氨基酸残基)，通过酰胺键与抗体共价结合。通过晶体X衍射发现蛋白与糖以对等方式相互作用而影响彼此构象。除了Fc片段糖基化外，30％的IgG在Fab片段存在N-糖基化，对抗体分子的功效产生有益、有害或中性影响。Fc糖基化糖分子具有复杂的双天线型核心结构，该结构由甘露糖(Man)和N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)两种戊糖分子组成，不同糖型除核心结构外还另外含有不同数目的糖分子，如岩藻糖(Fuc)，甘露糖，N-乙酰葡糖胺，半乳糖(Gal)，二等分N-乙酰葡糖胺和唾液酸。糖链的长度、分叉型式和单糖序列的变化导致了糖基化修饰的复杂性。另外由于各种酶的原因使得N-糖基化的五糖核心结构分为三类：高甘露糖型、杂合型和复杂型。

上式为免疫球蛋白Asn297位糖基化修饰的聚糖分子结构异质性结构式。

岩藻糖核心寡糖是在转运高尔基体中，通过-1,6-岩藻糖基转移酶从GDP-Fuc上转运来的岩藻糖残基生物合成而来。通过具有岩藻糖和无岩藻糖修饰的Fc片段结构分析表明：两者间Asp280和Asn297残基的电子密度存在差异；Tyr296残基的水合模式也存在差异。Lec13突变细胞表达的无岩藻糖修饰的人IgG表现出：与FcγRIIIa亲和力提高50倍，ADCC作用提高100倍。无核心岩藻糖使得FcγRIIIa受体中Asn162与Fc聚糖具有更高亲和力，因而结合更强。而岩藻糖的空间位阻会阻碍这种相互作用。这一发现导致人们对工程改造细胞系发生兴趣，从而制造了核心岩藻糖基化降低的抗体。

工程改造细胞系以降低核心岩藻糖基化的方法包括基因敲除、基因敲入和RNA干扰(RNAi)。在基因敲除中，编码FUT8(α1,6-藻糖基转移酶)的基因被灭活。FUT8催化岩藻糖残基从GDP-岩藻糖转移到N-聚糖的Asn-连接(N-连接)GlcNac的6位。据称，FUT8是唯一负责将岩藻糖加到N-连接双触角糖类Asn297上的酶。基因敲入是加入编码酶，如GNTIII或高尔基体α甘露糖苷酶II的基因。提高细胞中该酶的水平使单克隆抗体从岩藻糖基化途径转向(导致核心岩藻糖基化降低)，并具有升高量的二等分N-乙酰葡糖胺。RNAi通常也靶向FUT8基因表达，导致mRNA转录水平降低或完全敲除基因表达。

除了工程改造细胞系，还包括使用作用于糖基化途径的酶的小分子抑制剂。抑制剂，如凯特诺斯胺(catanospermine)，早期作用于糖基化途径，产生具有未成熟聚糖(例如，甘露糖水平高)和低岩藻糖基化水平的抗体。通过这些方法制得的抗体通常缺乏成熟抗体相关的复杂的N-连接聚糖结构。