[发明专利]基于鸡源类泛素蛋白融合表达体系的疫苗制备方法

权利要求书

1.基于鸡源类泛素蛋白融合表达体系的疫苗制备方法，其特征在于该方法中的抗原是将鸡自体类泛素蛋白SUMO-1、SUMO-2或SUMO-3基因，与鸡新城疫病毒或鸡传染性法氏囊病病毒的结构蛋白编码基因融合，再在大肠杆菌中进行表达从而获得的。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述SUMO-1基因的序列如SEQ ID No:1所示。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述SUMO-2基因的序列如SEQ ID No:2所示。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述SUMO-3基因的序列如SEQ ID No:3所示。

5.根据权利要求1所述的基于鸡源类泛素蛋白融合表达体系的疫苗制备方法，其特征在于该方法是将新城疫病毒截短F蛋白与SUMO-1基因融合；该方法包括以下步骤：

1)利用序列为TACACCTCATCCCAGACAGGATC和ACCAGTCATGCTAGCGCTGAGTTGATTGTTCCCTATACC的引物扩增新城疫病毒毒株B1的F蛋白表达基因；

2)利用序列为TGCCGCGCGGCAGCCATATGAGCGATCAGGAAGC和CTGGGATGAGGTGTAGGATCCACCGGTCTGTTC的引物扩增SUMO-1基因；

3)利用序列为TGCCGCGCGGCAGCCATATGTACACCTCATCCCAGACAGGATC和ACCAGTCATGCTAGCGCTGAGTTGATTGTTCCCTATACC的引物执行PCR扩增使F蛋白基因与pET28a(+)进行连接；

4)提取用于表达蛋白的质粒pET28a(+)，检测其浓度，并使用限制性内切酶NdeI进行单酶切；

5)将PCR获得的DNA及单酶切的质粒DNA进行1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，并切割目的条带，使用DNA凝胶回收试剂盒回收目的片段；

6)使用MultiS One step Cloing Kit进行片段的连接；其中，酶切后的质粒与SUMO-1、F蛋白基因进行连接；酶切后的质粒与F蛋白基因单独进行连接；

7)将连接产物转化后筛选阳性克隆，将获得的质粒分别转化至表达宿主E.coli BL21；通过筛选带有卡纳抗性的LB平板，得到正确的克隆；

8)从抗性平板上挑取单菌落接种于含有LB培养基的摇管中，37℃培养过夜；将培养得到的菌液以1％的接种量转接到含有50ml LB培养基的500ml三角瓶中，于37℃振荡培养至OD_620nm为0.6；向上述培养液中加入终浓度为1mM的IPTG，16℃摇床诱导表达8h；收集菌体，并用PBS洗涤两遍，然后PBS重悬菌体沉淀，同时调整OD_620nm至30；超声波破碎菌体细胞，12,000rpm低温离心10min，收集上清液；

9)将收集的上清液按比例加入10％甲醛溶液，甲醛溶液最终浓度为0.2％，37℃下进行灭活12h，以除去大肠杆菌；

10)将无菌的蛋白上清液进行配苗。

6.根据权利要求1所述的基于鸡源类泛素蛋白融合表达体系的疫苗制备方法，其特征在于该方法是将鸡传染性法氏囊病VP2蛋白与SUMO-1基因融合；该方法包括以下步骤：

1)利用序列为ATGACAAACCTGCAAGATCAAACC和TGTCCACCAGTCATGCTAGCTTACCTTATGGCCCGGATTATGT的引物扩增VP2蛋白表达基因；

2)利用序列为TGCCGCGCGGCAGCCATATGAGCGATCAGGAAGC和TGATCTTGCAGGTTTGTCATGGATCCACCGGTCTGTTC的引物扩增SUMO-1基因；

3)利用序列为TGCCGCGCGGCAGCCATATGATGACAAACCTGCAAGATCAAACC和TGATCTTGCAGGTTTGTCATTTACCTTATGGCCCGGATTATGT的引物执行PCR扩增使VP2蛋白基因与pET28a(+)进行连接；

4)提取用于表达蛋白的质粒pET28a(+)，检测其浓度，并使用限制性内切酶NdeI进行单酶切；

5)将PCR获得的DNA及单酶切的质粒DNA进行1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，并切割目的条带，使用DNA凝胶回收试剂盒回收目的片段；

6)使用MultiS One step Cloing Kit进行片段的连接；其中，酶切后的质粒与SUMO-1、VP2蛋白基因进行连接；酶切后的质粒与VP2蛋白基因单独进行连接；

7)将连接产物转化后筛选阳性克隆，将获得的质粒分别转化至表达宿主E.coli BL21；通过筛选带有卡纳抗性的LB平板，得到正确的克隆；

8)从抗性平板上挑取单菌落接种于含有LB培养基的摇管中，37℃培养过夜；将培养得到的菌液以1％的接种量转接到含有50ml LB培养基的500ml三角瓶中，于37℃振荡培养至OD_620nm为0.6；向上述培养液中加入终浓度为1mM的IPTG，16℃摇床诱导表达8h；收集菌体，并用PBS洗涤两遍，然后PBS重悬菌体沉淀，同时调整OD_620nm至30；超声波破碎菌体细胞，12,000rpm低温离心10min，收集上清液；

9)将收集的上清液按比例加入10％甲醛溶液，甲醛溶液最终浓度为0.2％，37℃下进行灭活12h，以除去大肠杆菌；

10)将无菌的蛋白上清液进行配苗。