[发明专利]基于鸡源类泛素蛋白融合表达体系的疫苗制备方法

说明书

本发明提供了一种基于鸡源类泛素蛋白融合表达体系的疫苗制备方法，该方法首先对SUMO‑1、SUMO‑2及SUMO‑3核苷酸序列按照大肠杆菌密码子的偏好性进行了优化。在此基础上，将SUMO蛋白编码序列连接至抗原蛋白编码基因N端，并连接到pET28a质粒，转化E.coli DH5α感受态细胞，得到重组质粒。测序确认无核苷酸突变后，转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞。本发明构建的融合表达体系，具有制备基因工程亚单位疫苗的明显优势，新城疫HI效价几何平均值达1:67‑1:80，鸡传染性法氏囊病琼扩效价为1:32‑1:64，均明显高于未使用鸡源SUMO蛋白融合表达效价。该方法还适用于蛋鸡减蛋综合症等鸡传染性疾病的亚单位疫苗制备。

技术领域

本发明涉及兽用生物制品技术领域，进一步涉及基因工程亚单位疫苗技术，具体涉及基于鸡源类泛素蛋白融合表达体系的疫苗制备方法。

背景技术

新城疫、鸡传染性法氏囊病、蛋鸡减蛋综合症等是严重危害养鸡业发展的重要疫病。目前，我国对这几种疾病的防控主要依赖于疫苗免疫。

新城疫(Newcastle disease，ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)引起的一种禽类急性、高度接触性传染病。新城疫病毒的感染能力主要是由两个外膜蛋白决定的:一个是血凝素神经氨酸酶(HN)，另一个是融合蛋白(F)。HN蛋白参与病毒粒子与宿主细胞表面受体吸附过程，F蛋白是NDV感染细胞所必需的，它不仅能促进病毒囊膜与宿主细胞膜融合，而且能促进相邻宿主细胞之间发生融合，是构成NDV致病力的重要成分，也是诱导机体产生中和抗体的主要抗原。

传染性法氏囊病(infectious bursal disease,IBD)是由传染性法氏囊病病毒(infectious bursal disease virus,IBDV)引起的一种急性、高度接触性传染病，该病仅使鸡感染致病死亡，生产性能下降，。IBDV主要侵害雏鸡的中枢免疫器官法氏囊，引起严重免疫抑制，从而导致免疫抑制和免疫缺陷，同时造成其他疫苗的免疫失败，是目前危害世界养禽业的主要传染病之一。VP2作为病毒主要结构蛋白，含有血清型特异性、能诱导中和抗体的构象依赖性抗原表位，其诱导的中和抗体能被动地保护宿主不受IBDV的感染，是IBD的保护性抗原。

在鸡传染性疾病的亚单位疫苗研发中，通过大肠杆菌表达体系表达关键抗原蛋白是一种常见方法。但常见问题表现为重组蛋白表达量低、修饰不完全造成的蛋白表达形式多为沉淀，蛋白结构错误折叠而导致免疫效力不够高，从而导致疫苗生产成本偏高。

类泛素蛋白SUMO是一种小分子泛素相关修饰蛋白，是存在于真核生物中参与蛋白质小泛素化修饰的一类高度保守的小分子蛋白。SUMO可作为重组蛋白表达的融合标签，具备分子伴侣的功能，能促进蛋白的正确折叠，对热和蛋白酶具有耐受性，有助于保持目的蛋白的稳定性。酿酒酵母中有一个SUMO基因(SMT3)，脊椎动物有三个SUMO基因，分别为SUMO-1、SUMO-2和SUMO-3。

目前，商业化载体中SUMO来源于酿酒酵母中，但根据目前报道，后续蛋白表达后需将该标签蛋白切除，工艺繁琐。通常，在体外环境中，SUMO蛋白酶还存在剪切效率问题，未经完全切除的酿酒酵母SUMO标签免疫动物后，还会存在针对标签的抗体产生免疫反应，或者遮蔽抗原蛋白免疫反应的现象。而自体来源的SUMO蛋白可避免类似问题的出现。目前尚未有关于利用鸡源类泛素蛋白融合表达体系，进行鸡传染性疾病关键抗原蛋白表达，从而制备重组亚单位疫苗的相关报道。

发明内容

本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种基于鸡源类泛素蛋白融合表达体系的疫苗制备方法，以解决现有技术中常规方法中抗原、可溶性蛋白的表达量及免疫效力较低的技术问题。

本发明要解决的另一技术问题是现有技术中常规方法多制备的产品其排异反应发生率较高。

为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：