[发明专利]利用CRISPR-CAS9技术敲除HEK293T细胞KDM2A基因的方法有效
| 申请号： | 201810325470.3 | 申请日： | 2018-04-12 |
| 公开（公告）号： | CN108504657B | 公开（公告）日： | 2019-06-14 |
| 发明（设计）人： | 彭勇波;许文豪;梁大焱 | 申请（专利权）人： | 中南民族大学 |
| 主分类号： | C12N15/113 | 分类号： | C12N15/113;C12N15/85;C12N15/90;C12N5/10 |
| 代理公司： | 武汉华旭知识产权事务所 42214 | 代理人： | 刘天钰 |
| 地址： | 430074 湖北*** | 国省代码： | 湖北;42 |
| 权利要求书： | 查看更多 | 说明书： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 验证 基因水平 敲除 蛋白质免疫印迹 细胞增殖和凋亡 基因缺陷型 突变细胞株 细胞基因组 蛋白水平 基因敲除 甲基化酶 细胞模型 细胞转染 信号通路 基因 制备 应用 研究 | ||
1.一种利用CRISPR-CAS9技术敲除HEK293T细胞中人源KDM2A基因的方法，其特征在于具体的方法如下：
（1）、细胞转染：培养HEK293T细胞至70～90%汇合度时准备转染，将含有表达载体pX458-KDM2A的混合液加入HEK293T细胞中进行转染，然后培养；
所述表达载体pX458-KDM2A的构建方法为：在14号外显子以及18号外显子上的靶序列的5’端加上BbsI的酶切位点caccg，依次构成序列SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2，并人工合成其互补序列SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4，将序列SEQ ID NO.1和SEQ ID NO：3，以及SEQ IDNO.2和SEQ ID NO：4所形成的双链DNA，与经过
（2）、细胞基因组提取：将转染后的HEK293T细胞进行基因组提取；
（3）、PCR鉴定：根据KDM2A基因序列，设计引物KDM2A-3F和KDM2A-3R、KDM2A-7F和KDM2A-7R，上述引物的序列分别如：SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示；利用上述引物对所提取的基因组进行PCR反应；
（4）、基因水平验证：将PCR产物测序，测序结果与野生型PCR序列比对，确定得到突变细胞株；
（5）、蛋白水平验证：在基因水平验证突变细胞株后，用蛋白质免疫印迹进一步验证上述突变细胞株是KDM2A基因缺陷型。
该专利技术资料仅供研究查看技术是否侵权等信息，商用须获得专利权人授权。该专利全部权利属于中南民族大学，未经中南民族大学许可，擅自商用是侵权行为。如果您想购买此专利、获得商业授权和技术合作，请联系【客服】
本文链接：http://www.vipzhuanli.com/pat/books/201810325470.3/1.html，转载请声明来源钻瓜专利网。
