[发明专利]利用CRISPR-CAS9技术敲除HEK293T细胞KDM2A基因的方法

说明书

本发明提供了一种CRISPR‑CAS9技术敲除HEK293T细胞KDM2A基因的方法，步骤如下：(1)、细胞转染；(2)、细胞基因组提取；(3)、PCR鉴定；(4)、基因水平验证；(5)、蛋白水平验证：在基因水平验证突变细胞株后，用蛋白质免疫印迹(Western blotting)进一步验证K3、K7‑1和K7‑2是KDM2A基因缺陷型。本发明还同时提供了利用上述方法制备的KDM2A基因敲除的HEK293T细胞系及以其作为细胞模型在研究KDM2A甲基化酶所涉及的细胞增殖和凋亡信号通路中的应用。

技术领域

本发明提供了一种利用CRISPR-CAS9技术敲除HEK293T细胞KDM2A基因的方法，属于基因工程技术领域。

背景技术

HEK细胞是来源于人源胚胎肾细胞，HEK293T细胞是HEK细胞的变种，是由其转染SV40大T抗原得到的可以体外增殖的细胞系，这种细胞系增殖快，转染效率高，常用于蛋白表达。赖氨酸依赖性去甲基化酶家族，对细胞增殖和凋亡具有极为重要的影响，这一特征决定了它可以作为肿瘤治疗的潜在应用。细胞癌变的显著特征之一就是甲基化酶和去甲基化酶的表达失调而引发的表观遗传调控功能紊乱。在该去甲基化酶家族中，KDM2A是截至目前研究仍不甚清楚的一个成员。KDM2A的主要功能是识别组蛋白H3的36号赖氨酸（H3K36）甲基化位点，使其去甲基化，使异染色质结构稳定并促进该区域的基因表达，以发挥该基因的原癌基因功能。现有研究表明，多种癌症的发生均与其表达上调有关，如肠癌、肺癌和乳腺癌等。现有研究表明，KDM2A能够促进细胞生长和迁移，但是对于它如何影响细胞凋亡仍不清楚。因此，构建KDM2A的敲除细胞系，并以此用于细胞凋亡信号通路的研究是极为重要的，构建成功的细胞系可用于蛋白水平表达、转录组分析以及其他多种实验用途。虽然目前有部分关于KDM2A基因沉默以及RNA干扰的相关报道，但是与基因敲除相比，基因敲除的效果更为彻底，更有利于研究KDM2A对细胞增殖和凋亡作用的影响。

发明内容

本发明解决了现有技术中的不足，提供了一种CRISPR-CAS9技术敲除HEK293T细胞KDM2A基因的方法。本发明还同时提供了利用上述方法制备的KDM2A基因敲除的HEK293T细胞系及以其作为细胞模型在研究KDM2A甲基化酶所涉及的细胞增殖和凋亡信号通路中的应用。

实现本发明上述目的所采用的技术方案为：

一种基于CRISPR/CAS9系统的特异性敲除人源KDM2A基因的sgRNA，所述sgRNA在KDM2A基因上的靶序列位于KDM2A基因（NM_012308.2）的14号和18号外显子上，其中14号外显子上的靶序列为：5’-ACATCGCACTCGTCTCCGTC-3’，18号外显子上的靶序列为：5’-TTTGAAGCGCTCATCGCGGC-3’。

本发明同时提供了上述sgRNA的表达载体pX458-KDM2A。所述表达载体pX458-KDM2A的构建方法如下，在14号外显子上以及18号外显子上的靶序列的5’端加上BbsI的酶切位点caccg，依次构成序列SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2，并人工合成其互补序列SEQ IDNO：3和SEQ ID NO：4，将互补序列SEQ ID NO.1和SEQ ID NO：3，以及SEQ ID NO.2和SEQ IDNO：4所形成的双链DNA，与经过BbsI酶切的pX458载体连接，从而制得表达载体pX458-KDM2A。

进一步的，本发明提供了一种KDM2A基因敲除的HEK293T细胞系以及所述的KDM2A基因敲除的HEK293T细胞系的构建方法，包括以下步骤：以表达载体pX458-KDM2A作为KDM2A基因的打靶载体，转染HEK293T细胞，获得的KDM2A基因敲除的单克隆细胞株，分别简记为K3，K7-1和K7-2。

具体的构建方法如下：