[发明专利]基于CRISPR-链取代的等温扩增及检测技术

说明书

本发明公开了基于CRISPR‑链取代的等温扩增及检测技术。基于CRISPR‑链取代的等温扩增试剂盒，包括链取代等温扩增试剂，试剂盒还包括了野生型Cas9和/或核酸酶缺陷的Cas9切口酶、特异性识别目标DNA序列上下游的sgRNA对，链取代等温扩增反应的扩增引物对，该引物对与Cas9‑sgRNA复合体对与目的基因结合后暴露出的单链区域互补。该技术操作简单，抗干扰能力强，检测结果准确可靠。

技术领域

本发明涉及一种核酸扩增技术及基于该技术的检测技术，特别涉及基于CRISPR-链取代的等温扩增及检测技术。

背景技术

核酸分子基于其生物特性被视为重要的生物标志物。核酸分子的检测在医学诊疗、食品安全、公共卫生和社会安全等方面有着广泛的应用。通常，在核酸检测过程中，待检样品中的靶核酸分子浓度极低，而非靶核酸分子浓度则较高。因此，对待检测样品中的靶核酸分子特异性扩增是提高核酸检测反应的灵敏度和准确度的常用方法。

目前，通过PCR扩增技术特异性地扩增待检测样品中的靶核酸分子(DNA)片段是核酸检测中使用的最主要的技术，也是目前最有效、最直接的方法。然而，PCR技术目前仍具有诸多难以克服的限制，例如：1)对模板DNA纯度要求高；2)对反应条件敏感，而实际待检测样品中往往存在对PCR反应有抑制作用的成分；3)扩增反应需经历多重变温反应，反应时间较长；4)检测反应所需设备及结果分析设备成本较高，只能在实验室完成；以及5)检测所需试剂成本高，且使用操作需经过专业培训，相关检测需耗费大量人力物力成本。同时，在医学诊疗、食品安全相关的实际检测中，需要开展实地检测，并尽可能在短的时间内获得靶核酸分子的检测结果。因此，基于PCR技术的核酸检测手段无法满足实际应用的需求，新的低成本，高效快速的核酸检测手段将因此具有广泛的应用潜力。

针对上述问题，研究人员开发出了一系列核酸的等温扩增技术(IsothermalAmplification)以解决PCR扩增技术中面临的诸多问题。针对于DNA的检测，通常利用具有链取代功能的聚合酶(如Klenow Fragment，Bst，等)，在有切口酶(如SDA技术)或无切口酶(如LAMP、RCA、HDA和RPA等技术)参与下，在1-2小时内将靶DNA的扩增至可被检测的水平(Isothermal in vitro amplification of DNA by a restriction enzyme/DNApolymerase system,Walker GT等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,1992,89(1):392–396；Loop-mediated isothermal amplification of DNA,Notomi T等,Nucleic Acids Res.,2000,28(12):e63；Rolling replication of short DNA circles,Fire A等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,1995,92(10):4641–4645；Helicase-dependent isothermalDNA amplification,Vincent M等,EMBO Rep.,2004,5(8):795–800；DNA detection usingrecombination proteins,Piepenburg O等,PLoS Biol.,2006,4(7):e204)。