[发明专利]地衣芽孢杆菌DW2ΔbcaP在杆菌肽生产中的应用

权利要求书

1.通过敲除bcaP基因改造氨基酸代谢途径得到的地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）DW2ΔbcaP在杆菌肽生产中的应用，所述的地衣芽孢杆菌DW2ΔbcaP的具体构建方法包括以下步骤：

（1）以地衣芽孢杆菌DW2的基因组DNA为模板，PCR扩增出bcaP基因的上游同源臂和bcaP基因的下游同源臂；再利用重叠延伸PCR方法将bcaP基因的上游同源臂和bcaP基因的下游同源臂拼接在一起，得到融合基因序列A；

（2）采用限制性内切酶XbaⅠ和BamHI对步骤（1）得到的融合基因序列A进行双酶切，得到酶切基因序列A；

（3）准备质粒 T2(2)-ori，并采用限制性内切酶XbaⅠ和BamHI对质粒T2(2)-ori进行双酶切，得到酶切质粒T2(2)-ori；

（4）将步骤（2）得到的酶切基因序列A连接到步骤（3）得到的酶切质粒T2(2)-ori中，得到bcaP基因敲除质粒T2(2)-ori-bcaP；

（5）将bcaP基因敲除质粒T2(2)-ori-bcaP转入地衣芽孢 杆菌DW2中，经卡那霉素抗性筛选得到阳性转化子，抽质粒进行菌落PCR验证，将验证成功的阳性转化子在45℃条件下转接培养数次后，进行菌落PCR检测，得到bcaP基因的上游臂或bcaP基因的下游臂与地衣芽孢杆菌DW2基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株；

（6）挑选bcaP基因的上游臂与地衣芽孢杆菌DW2基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株与bcaP基因的下游臂与地衣芽孢杆菌DW2基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株混合接种于37℃、不含有卡那霉素的培养基中经过数次转接培养，PCR法筛选得到敲除bcaP基因的地衣芽孢杆菌DW2ΔbcaP；

其中上述步骤中的地衣芽孢杆菌DW2均为于2011年10月12日保藏于位于武汉的中国典型培养物保藏中心、保藏编号为CCTCC NO：M2011344的地衣芽孢杆菌DW2；

所述地衣芽孢杆菌DW2的基因组DNA序列中的bcaP基因如SEQ ID NO.1 所示。

2.根据权利要求1所述的通过敲除bcaP基因改造氨基酸代谢途径得到的地衣芽孢杆菌DW2ΔbcaP在杆菌肽生产中的应用，其特征在于，该应用步骤包括： A种子发酵，B生产发酵。

3.根据权利要求2所述的通过敲除bcaP基因改造氨基酸代谢途径得到的地衣芽孢杆菌DW2ΔbcaP在杆菌肽生产中的应用，其特征在于，所述种子发酵的培养基配方为：8-10g/L蛋白胨，3-6g/L酵母浸出粉，7-10g/L氯化钠，pH 7.0 ~ 7.2。

4.根据权利要求2所述的通过敲除bcaP基因改造氨基酸代谢途径得到的地衣芽孢杆菌DW2ΔbcaP在杆菌肽生产中的应用，其特征在于，所述生产发酵的培养基配方为：80-100g/L豆粕；15-45g/L玉米淀粉；4-8 g/LCaCO₃和0.5-2 g/L (NH4)₂SO₄。