[发明专利]地衣芽孢杆菌DW2ΔbcaP在杆菌肽生产中的应用

说明书

本发明提供通过敲除bcaP基因改造氨基酸代谢途径得到的地衣芽胞杆菌DW2ΔbcaP在杆菌肽生产中的应用，本发明通过基因工程的方法通过在地衣芽胞杆菌DW2基因组DNA序列中敲除bcaP基因，得到地衣芽胞杆菌DW2ΔbcaP，相对于地衣芽胞杆菌DW2来说，该菌株在杆菌肽发酵过程中发酵液中杆菌肽的产量提高了11％以上。

技术领域

本发明涉及地衣芽孢杆菌菌株改造领域，尤其是一种通过改造氨基酸代谢途径制备地衣芽孢杆菌的方法及所得菌株的应用。

背景技术

地衣芽孢杆菌通过非核糖体合成酶能够合成次级代谢产物—杆菌肽。杆菌肽是一类由12个氨基酸残基组成的环肽类抗生素，杆菌肽的组成氨基酸包括鸟氨酸(Orn)，D-苯丙氨酸(D-Phe)，异亮组氨酸(His),D-天冬氨酸(D-Asp), 天冬酰胺(Asn)、赖氨酸(Lys),D-谷氨酸(D-Glu)，半胱氨酸(Cys)，亮氨酸(Leu)，异亮氨酸(Ile)和缬氨酸(Val)11种氨基酸。杆菌肽为一种广谱抗菌素，其主要通过抑制细胞壁的合成来抑制细菌的生长。杆菌肽能够有效抑制革兰氏阳性菌，如梭状芽孢杆菌属、葡萄球菌属，链球菌属、棒状杆菌属和奈瑟球菌属等，对部分革兰氏阴性菌如脑膜炎双球菌、流感杆菌、放线菌也有较好的抑制作用。杆菌肽几乎不会在动物的肠道内被吸收，而且排泄迅速，没有残留，因此被广泛应用于饲料添加。

目前，鉴于组成杆菌肽的这12种氨基酸在枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌内的含量并不清楚，哪种或哪几种氨基酸是限制杆菌肽高产的关键氨基酸也尚不清楚。并且，虽然，现有技术中已公布：氨基酸转运蛋白BcaP是芽胞杆菌体内一种重要的氨基酸转运蛋白。但是，关于BcaP具体会影响哪些氨基酸的转运并不清楚，关于BcaP是负责目标氨基酸的转入还是转出也不清楚。再加上，细胞内的氨基酸具有严格、且复杂的调控机制，因此，想要通过改造氨基酸代谢途径制备地衣芽孢杆菌来提高杆菌肽产量并非易事。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种通过改造氨基酸代谢途径制备地衣芽孢杆菌的方法，此构建方法是通过敲除地衣芽孢杆菌DW2基因组中的氨基酸转运蛋白(简称“BcaP”)的基因(简称“bcaP”)来构建地衣芽孢杆菌基因工程菌，所得到的基因工程菌的杆菌肽产量有了大幅提升。

一种通过改造氨基酸代谢途径制备地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis) 的方法，包括以下步骤：

(1)以地衣芽孢杆菌DW2的基因组DNA为模板，PCR扩增出bcaP基因的上游同源臂和bcaP基因的下游同源臂；再利用重叠延伸PCR方法将bcaP基因的上游同源臂和bcaP基因的下游同源臂拼接在一起，得到融合基因序列A；

(2)采用限制性内切酶XbaⅠ和BamHI对步骤(1)得到的融合基因序列A进行双酶切，得到酶切基因序列A；

(3)准备质粒T2(2)-ori，并采用限制性内切酶XbaⅠ和BamHI对质粒T2(2)-ori 进行双酶切，得到酶切质粒T2(2)-ori；

(4)将步骤(2)得到的酶切基因序列A连接到步骤(3)得到的酶切质粒T2(2)-ori中，得到bcaP基因敲除质粒T2(2)-ori-bcaP；

(5)将bcaP基因敲除质粒T2(2)-ori-bcaP转入地衣芽胞杆菌DW2中，经卡那霉素抗性筛选得到阳性转化子，抽质粒进行菌落PCR验证，将验证成功的阳性转化子在45℃条件下转接培养数次后，进行菌落PCR检测，得到bcaP基因的上游臂或bcaP基因的下游臂与地衣芽孢杆菌DW2基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株；

(6)挑选bcaP基因的上游臂与地衣芽孢杆菌DW2基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株与bcaP基因的下游臂与地衣芽孢杆菌DW2基因组DNA 产生单交换的阳性单交换结合子菌株混合接种于37℃、不含有卡那霉素的培养基中经过数次转接培养，PCR法筛选得到敲除bcaP基因的地衣芽胞杆菌DW2 ΔbcaP；