[发明专利]一种ESCRT-III核心亚基Snf7类双链RNA及其制备方法及应用

权利要求书

1.一种干扰Snf7基因表达的ESCRT-III核心亚基Snf7类双链RNA，其特征在于，其转录模板的正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.权利要求1所述的ESCRT-III核心亚基Snf7类双链RNA的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1)提取褐飞虱总RNA：取成虫，于液氮中研磨，用TRIzol法提取总RNA；

2)合成cDNA第一链：将1μg总RNA反转录为cDNA；

3)制备褐飞虱Snf7同源基因Nl020727基因中间片段，并制备含有所述中间片段的载体；

4)以步骤3)得到的载体为模板，扩增得到目的片段，即所述ESCRT-III核心亚基Snf7类双链RNA；

所述步骤3)的具体操作如下：

步骤1、聚合酶链式反应：试剂包括cDNA 1.5μL、10μM的所述Nl020727基因特异性上游引物Nl020727-F 2μL、10μM的所述Nl020727基因特异性下游引物Nl020727-R 2μL、2×Phanta Max Buffer 25μL、dNTP mix 1μL、Phanta Max Super-Fidelity DNA Ploymerase1μL、双蒸水17.5μL；将所述试剂混合得到混合液，总体积为50μL；所述聚合酶链式反应的具体步骤如下：将所述混合液95℃预变性3min，然后进入下列循环：95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸50s，共30个循环，最后72℃再延伸7min；其中，扩增所述Nl020727基因特异性片段的上游引物Nl020727-F的序列为：5’-CCCTTTCACTACTACTCATCTTCA-3’；下游引物Nl020727-R的序列为：5’-GTTCTTCTTCTTCTTTTTCTTCCT-3’；

步骤2、扩增产物纯化：使用Magen凝胶回收试剂盒纯化PCR扩增片段，得到纯化产物；

步骤3、中间载体获得：将所述纯化产物按照连接反应体系，克隆到pEASY-Blunt Zero载体，转化到Trans1-T1感受态细胞，在含有100μg/mL氨苄青霉素的LB平板上过夜培养，得到菌落；所述连接反应体系为：纯化产物4μL，pEASY-Blunt Zero 1μL，总体积共5μL；

步骤4、质粒纯化：将所述菌落接种于LB液体培养基，37℃摇床过夜培养后收取菌液，抽提质粒，得到含有Nl020727基因的质粒pEASY—020727；

所述步骤4)的具体操作如下：

步骤a、设计以下特异性引物：

dsNl020727-F：5’-AATGAAGGGAAGAGAGATCGTGCCAAA-3’

dsNl020727-R：5’-TACAGCCTCATCATCCTCAGCAGTCA-3’

dsNl020727-T7F：

5’-GGATCCTAATACGACTCACTATAGGAATGAAGGGAAGAGAGATCGTGCCAAA-3’

dsNl020727-T7R：

5’-GGATCCTAATACGACTCACTATAGGTACAGCCTCATCATCCTCAGCAGTCA -3’

步骤b、以所述含有Nl020727基因的质粒为模板，使用所述步骤a中的特异性引物分别按照以下反应条件扩增，得到目的片段：

A反应体系如下：

B反应体系如下：

PCR仪扩增程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸35s，30个循环；72℃再延伸10min；

其中，通过dsRNA合成试剂盒合成所述Nl020727基因对应的双链RNA。

3.权利要求1所述的ESCRT-III核心亚基Snf7类双链RNA在制备用于防治褐飞虱的药物中的应用。

4.一种防治褐飞虱的方法，其特征在于：使用权利要求1所述的ESCRT-III核心亚基Snf7类双链RNA对褐飞虱进行注射。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：注射所述ESCRT-III核心亚基Snf7类双链RNA的终浓度为0.025μg/μL至0.2μg/μL。

6.一种防治褐飞虱杀虫剂，其特征在于包括权利要求1所述的ESCRT-III核心亚基Snf7类双链RNA作为活性成分。