[发明专利]一种黑果枸杞耐盐突变体的离体筛选方法

权利要求书

1.一种黑果枸杞耐盐突变体的离体筛选方法，包括以下步骤：

1)将NaCl溶液浸泡处理过的黑果枸杞种子接种于无菌苗培养基中进行培养，获得无菌苗；

2)将所述无菌苗的叶片接种于含NaCl的胚性愈伤组织诱导培养基中进行愈伤组织培养，获得胚性愈伤组织颗粒；

3)将所述胚性愈伤组织颗粒接种于NaCl胁迫不定芽诱导培养基中进行不定芽培养，获得不定芽；

4)对所述不定芽进行NaCl胁迫培养，获得预耐盐不定芽；

5)对所述预耐盐不定芽进行EMS诱变处理后筛选耐盐不定芽；

6)将所述筛选得到的耐盐不定芽进行生根培养，获得黑果枸杞耐盐试管苗；

步骤2)中所述的胚性愈伤组织诱导培养基为MS+NaCl+0.5~1.5mg/L 6-BA+0.2~0.8mg/L NAA+300~500mg/L脯氨酸+30~35g/L蔗糖；所述胚性愈伤组织诱导培养基的pH值为5.5~6.0；

步骤3)中所述的NaCl胁迫不定芽诱导培养基为MS+0.2~0.4mg/L 6-BA+1.0~2.0mg/L2,4-D+4.5~5.5g/L NaCl+28~32g/L蔗糖+4.5~5.0g/L琼脂；所述NaCl胁迫不定芽诱导培养基的pH值为5.5~6.0；

步骤1)中所述的NaCl溶液浸泡处理包括两轮高温浸泡-低温浸泡；所述高温浸泡的温度为38~42℃，所述高温浸泡的时间为1.5~2.5h；所述低温浸泡的温度为12~17℃，所述低温浸泡的时间为1.5~2.5h；

步骤2）中所述愈伤组织培养依次包括黑暗震荡培养阶段和光照静置培养阶段；所述黑暗震荡培养阶段的温度为23~27℃；所述黑暗震荡培养的转速为15~25rpm；所述黑暗震荡培养的震荡时间为6~10h/d；

步骤4）中所述NaCl胁迫培养获得预耐盐不定芽过程依次包括预耐盐培养阶段和预耐盐筛选阶段；所述预耐盐培养阶段的培养基与步骤3)中所述的NaCl胁迫不定芽诱导培养基一致；所述预耐盐筛选阶段的培养基为MS+1.0~1.5mg/L KT+0.3~0.6mg/L NAA+28~32g/L蔗糖+4.5~5.0g/L琼脂；

步骤5)中所述EMS诱变处理的EMS诱变液的浓度为3.5~4.5mg/L，所述EMS诱变处理的时间为8~10h；所述EMS诱变处理的转速为8~12rpm；

步骤5）中筛选耐盐不定芽的培养基为MS+0.45~0.55mg/L 6-BA+0.1~0.3mg/L IBA+4.5~5.5g/L NaCl+28~32g/L蔗糖+4.5~5.0g/L琼脂。

2.根据权利要求1所述的离体筛选方法，其特征在于，步骤1)中所述的NaCl溶液的浓度为80~150mg/L。

3.根据权利要求1所述的离体筛选方法，其特征在于，步骤1)中所述的培养获得无菌苗的过程包括依次进行的3~5d暗培养和2~10d光照培养。

4.根据权利要求1所述的离体筛选方法，其特征在于，所述黑暗震荡培养的时间为6~8d；所述光照静置培养的时间为6~8d。

5.根据权利要求1所述的离体筛选方法，其特征在于，所述愈伤组织培养在静置培养阶段后还包括梯度耐盐培养；所述梯度耐盐培养为每12~14d向所述胚性愈伤组织诱导培养基中添加NaCl。