[发明专利]一株枯草芽孢杆菌及其制备方法

权利要求书

1.一株枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）△WB800，于2018年 1 月 24 日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO: M 2018055，分类命名为枯草芽孢杆菌△WB800，其特征在于：以枯草芽孢杆菌WB800的基因组为模板，敲除与细胞自溶相关的skfA、sdpC、lytC、xpf基因，最终获得的枯草芽孢杆菌多重细胞自溶相关基因缺失菌株△WB800。

2.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌△WB800的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）以枯草芽孢杆菌WB800的基因组为模板，分别扩增得到要敲除的目的基因上、下游同源臂的序列；

2）通过酶切位点将上、下同源臂与温敏型载体pGK12进行连接并转化到大肠杆菌中进行扩增，获得大量敲除载体；

3）利用二步化学转化法将步骤2）构建好的敲除载体转化到待敲除基因的枯草芽孢杆菌WB800菌株中，使用低于37 ℃的温度在含有氯霉素抗性的LB培养基培养，以维持该敲除载体的正常复制；

4）步骤3）中得到的含敲除载体的WB800，在37 ℃的LB液体培养基中生长12-16 h后，取500μL，转接到5mL含氯霉素抗性的LB培养基中，并置于45 ℃培养6-12 h；

5）取步骤4）得到的菌液500μL转入新的5mL含氯霉素抗性的LB液体培养基，置于50 ℃条件下培养6-12 h；

6）此时，将上述步骤5）得到的含有质粒整合到基因组上的菌株接种到液体无抗LB培养基中，于37 ℃培养，连续无抗传代8-12次；

7）取步骤6）的菌液在不含抗生素的LB平板上划线分单菌落，检测不含抗性的菌落，PCR验证其基因敲除情况，如果验证片段大小正确，此时将成功获得单一目的基因敲除菌株；

8）上述1)-7)的方法成功敲除第一个基因后，在此基础上同样沿用步骤1)-7)的方法，依次敲除另外三个与细胞自溶相关的基因，最终获得枯草芽孢杆菌四重细胞自溶相关基因缺失菌株△WB800。

3.权利要求2所述的枯草芽孢杆菌△WB800的制备方法，其特征在于，步骤2）中，所述酶切位点包括HindIII、PstI和EcoRI。

4.权利要求2所述的枯草芽孢杆菌△WB800的制备方法，其特征在于，步骤2）中，所述上、下同源臂与温敏型载体pGK12是通过T4连接酶进行连接的。

5.权利要求2所述的枯草芽孢杆菌△WB800的制备方法，其特征在于，所述LB培养基的配方如下：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，氯霉素7.5μg/mL。

6.权利要求2所述的枯草芽孢杆菌△WB800的制备方法，其特征在于，所述LB平板的配方如下：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，琼脂粉15g/L。