[发明专利]一株枯草芽孢杆菌及其制备方法

说明书

本发明涉及一株枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)ΔWB800及其制备方法，属于生物工程技术领域。本发明通过对枯草芽孢杆菌WB800菌株自溶相关基因skfA、sdpC、lytC、xpf的敲除，获得了自溶抑制菌株Δ800，该菌株具有耐热、耐酸、耐胆盐的优良性能，显现出了较好的工业应用前景。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地，本发明涉及一株经遗传改造后细胞自溶被抑制的枯草芽孢杆菌及其制备方法。

背景技术

枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)是在自然环境中正常存在的、革兰氏阳性、形成芽胞的非病原微生物菌。作为目前研究得最多的革兰氏阳性土壤细菌和模式微生物之一，枯草芽胞杆菌是公认的GRAS(Generally recognized as safe)菌株，被广泛用于动植物病害的生物防治、植物生长促进剂、益生菌、工业酶类的生产及异源蛋白的表达等诸多领域。

在枯草芽胞杆菌数十年的研究中人们为了提高枯草芽胞杆菌的生物量以及蛋白产量做出了巨大的努力，并取得了不少优良的成果。蛋白酶缺失突变株的构建是其中最广为认知的一个方面。我们知道，枯草芽胞杆菌为分解利用其所处环境中物质，分泌大量的各种酶类，其中很重要的一类就是蛋白酶，而且蛋白酶也在其清除细胞自身错误折叠或未成熟的蛋白质方面起着重要的作用。然而，这些蛋白酶的存在大大的增加了使用枯草芽胞杆菌进行异源表达时目标蛋白被降解的风险。通过生物信息学分析发现，枯草芽胞杆菌的基因组至少编码24个已知蛋白酶以及6个推测的蛋白酶。为了减少重组蛋白被降解的风险以提高蛋白表达产量，人们不断的尝试着对枯草芽胞杆菌的蛋白酶进行缺失。目前构建了一系列蛋白酶缺失菌株WB600、WB700及WB800。尽管WB800有时需要在30℃培养以避免包涵体的形成，但是WB800表达的蛋白质稳定性比WB700有进一步的提高，即使在培养48小时后仍没有蛋白质降解发生。

细胞自溶现象在枯草芽胞杆菌中普遍存在，是制约其产量提高的一个重要因素。值得注意的是研究发现，当蛋白酶缺失时会导致细胞在从对数生长期向稳定期过渡时细胞自溶的增加。这可能是由于蛋白酶与细胞内自溶酶的降解有关，而自溶酶的累积会导致细胞发生裂解自溶。细胞自溶酶是细胞中普遍存在的一类水解酶，它们在细胞的正常生命中扮演者重要角色。然而既然它们的累积会导致枯草芽胞杆菌生物量的降低。那么我们是否可以通过基因敲除技术来抑制细胞自溶进而达到提高枯草芽胞杆菌生物量的目的呢？

微生态制剂也叫活菌制剂、益生素，它是可以直接饲喂的有益活体微生物制剂。通过维持肠道内微生态平衡而发挥作用，具有防治疾病、增强机体免疫力、促进生长、增加体重等多种功能，且无污染、无残留、不产生抗药性，可作为抗生素的替代品应用于饲料添加剂中。其中，枯草芽孢杆菌是我国农业部公布的可直接饲喂动物且允许使用的饲料级益生菌菌种之一。已有枯草芽孢杆菌被制成无毒副作用、无残留的绿色饲料添加剂。该类产品要求能耐高温、耐酸、耐盐，在配合饲料制粒过程中以及通过酸性胃环境保持稳定。这样到达动物肠道内后才能在动物体内发挥诸多有益作用，提高动物的健康水平和生产性能。因此开发一种能够耐热且耐受酸和胆盐的枯草芽孢杆菌菌株对于降低微生态制剂生产成本，强化微生态制剂功效具有重要意义。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于从枯草芽孢杆菌蛋白酶缺失菌株WB800出发，经过一系列自溶相关基因敲除，得到一株自溶现象明显被抑制，且更加耐热、耐酸和耐胆盐处理的枯草芽胞杆菌菌株。本发明中使用大肠杆菌与芽胞杆菌的穿梭载体pGK12构建目的基因的敲除载体，其具有氯霉素抗性基因；pGK12在芽胞杆菌中为温敏型复制，其温度敏感型的复制区在相对较低的37℃下可以正常复制，而温度高于50℃无法正常复制。因而可以利用高温来筛选质粒是否与基因组发生了整合。

为了达成上述的目的，本发明提供了一株枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)△WB800，于2018年1月24日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址为：中国，武汉，武汉大学，邮政编码：430072)，其保藏编号为M2018055，分类命名为枯草芽胞杆菌△WB800(Bacillussubtilis △WB800)。