[发明专利]一种融合蛋白PTEN-L-p53及其应用

说明书

本申请属于肿瘤治疗相关技术领域，具体涉及一种融合蛋白PTEN‑L‑p53及其应用的专利申请。该蛋白制备时包括：对PTEN‑L前导序列和TP53分别进行PCR扩增、融合PCR制备PTEN‑L‑p53融合序列、酶切与连接、转化与筛选鉴定等步骤。本申请中，以具有自由进出细胞功能的PTEN‑L前导序列与具有抑制肿瘤功能的p53融合制备了融合蛋白。初步研究表明，所制备融合蛋白能够自由进出细胞，并且具备p53的肿瘤抑制功能和抑制侵袭功能，表现出较好的应用前景。本申请所提供的融合蛋白PTEN‑L‑p53作为一种人类内源性蛋白，可以较好避免免疫原性，提高相关治疗性蛋白的实用性。

技术领域

本申请属于肿瘤治疗相关技术领域，具体涉及一种融合蛋白PTEN-L-p53及其应用的专利申请。

背景技术

PTEN（第10号染色体缺失的磷酸酶和张力蛋白的同源基因）是癌症中最常见的肿瘤抑制基因。经典PTEN通过拮抗PI3K / Akt信号的传导来抑制肿瘤发生，在维持细胞稳定性方面起着关键作用。PTEN是阻断肿瘤发生和防止肿瘤细胞侵袭的重要肿瘤抑制因子，PTEN-L是PTEN基因翻译中的一个亚型，能够从细胞内自由地分泌出来并且能够再次进入受体细胞以抑制AKT活性。在结构上，相比于经典PTEN从起始密码子（ATG）开始，PTEN-L额外编码N-173个氨基酸扩增区。PTEN-L自由进出细胞的关键是前导序列中包含一个多聚丙氨酸分泌序列和多聚精氨酸重进序列（重进，重新进入，多聚精氨酸能够促进PTEN-Long再次透过细胞膜进入受体细胞）。

在人类恶性肿瘤中，TP53（野生型）是一种肿瘤抑制因子，能够响应各种内外应激信号，包括DNA损伤，癌基因激活等。它是除了PTEN基因以外在肿瘤中频繁突变的一个基因。p53的生物学功能与其亚细胞定位高度相关。其中，核TP53是一个众所周知的转录调节因子，它通过DNA结合域调控各种靶基因的表达，涉及细胞周期阻滞、细胞凋亡、抑制转移和血管生成等。此外，p53在细胞质中通过抑制细胞侵袭和凋亡来维持细胞稳态。很多研究人员以正常的TP 53运送到肿瘤组织纠正TP53-异常，但是由于膜屏障作用，p53蛋白无法自由透过细胞膜进入细胞内发挥生物学功能。

理想情况下，基因治疗是通过安全有效的途径及传送载体将某些正常的基因传送进细胞内去矫正突变的基因以达到治疗肿瘤的目的。在传送的过程当中，安全有效的并且能够直接将基因传送至靶点的传送载体是必要条件。然而，将外源性基因直接传送至细胞内以攻克肿瘤的有效性及特异性都是极低的，成为基因治疗中最大的阻碍。因此，实际应用时效果较为有限。而现有技术中尚未见到较好的将PTEN-L前导序列与内源性非分泌性p53进行结合的报道。

发明内容

本申请目的在于提供一种融合蛋白PTEN-L-p53，该蛋白通过将PTEN-L leader序列（PTEN-L引导序列）与TP53进行融合得到融合基因PTEN-L-p53，通过对该融合蛋白的分泌性及生物学功能进行研究，从而为相关肿瘤的治疗奠定基础。

本申请所采取的技术方案详述如下。

一种融合蛋白PTEN-L-p53，通过如下步骤制备获得：

（1）序列扩增及融合

对PTEN-L前导序列和TP53（基因）分别进行PCR扩增，

所述PTEN-L前导序列，包括519bp，碱基序列如SEQ ID NO.1所示，具体如下：