[发明专利]一种南果梨愈伤组织、培养方法及应用

说明书

本发明属于植物愈伤组织培育技术领域，具体涉及一种南果梨愈伤组织的培养方法及应用。该方法先将南果梨果实用体积分数70％乙醇溶液和1.8g/100ml的次氯酸钠溶液浸泡消毒，无菌水清洗，得到无菌果实；然后采用特定的诱导培养基和继代培养基进行培养，最终得到南果梨愈伤组织。本发明培养的南果梨愈伤组织生长能力旺盛呈白色疏松状，质地较软，分散性好，且生长速度快。克服了现有方法培养出的南果梨愈伤组织质地较硬，生长缓慢且易老化变黑的问题。

技术领域

本发明属于植物愈伤组织培育技术领域，具体涉及一种南果梨愈伤组织、培养方法及应用。

背景技术

由于南果梨童期较长，给利用其果实进行基因定位的GUS染色实验，验证蛋白互作的免疫共沉淀实验，验证转录因子与启动子互作的染色质免疫共沉淀实验及验证基因功能的基因沉默与过表达等实验带来了很大难度。而植物愈伤组织很好地解决了上述问题，如李通等在《Plant Cell》上发表的《The Jasmonate-Activated Transcription FactorMdMYC2Regulates ETHYLENE RESPONSE FACTOR and Ethylene Biosynthetic Genes toPromote Ethylene Biosynthesis during Apple Fruit Ripening》即为利用苹果的愈伤组织进行的免疫共沉淀及染色质免疫共沉淀实验，这就为植物生理活性研究提供了新思路。

愈伤组织是指由母体外植体组织脱分化而不断增殖产生的一团不定性的疏松排列的薄壁细胞。参考文献《不同激素种类和配比对杜梨组培继代苗愈伤组织发生及状态的影响》利用愈伤组织的诱导来获得植物的代谢物质是国内外研究的重要技术手段，因此建立南果梨愈伤组织培养体系显得尤为必要。然而目前报道的南果梨愈伤组织是用叶、子房及茎段诱导的，由于南果梨果实细胞水分含量较大，传统的植物愈伤组织诱导及继代激素配比并不适用于南果梨愈伤组织的培养，目前还没有研究使用南果梨果实诱导愈伤组织。我们参考培养晋蜜梨果实愈伤的诱导及继代浓度，发现诱导培养基无法诱导出南果梨果实愈伤组织，继代培养基上生长的愈伤组织质地较硬，且易老化变黑。因此，需要对现有的愈伤组织培养方法进行改进，以适应南果梨果实诱导愈伤组织。

发明内容

本发明的目的是提供一种南果梨愈伤组织、培养方法及应用，解决了现有技术中南果梨果实无法诱导出愈伤组织；或生长的愈伤组织质地较硬，易老化变黑的问题。

本发明提供的一种南果梨愈伤组织的培养方法，包括以下步骤：S1，取成熟且完整的南果梨果实，依次用体积分数70％乙醇溶液和1.8g/100ml的次氯酸钠溶液浸泡消毒，无菌水清洗，得到无菌果实；

S2，将所述无菌果实去皮，然后切下果肉，平铺到诱导培养基中，25～28℃暗培养，直至长出愈伤组织，得到带有愈伤组织的果肉；

所述诱导培养基按以下方法配制：1L水中加入7g琼脂粉，煮沸至琼脂粉完全溶解，然后加入4.74g MS固体培养基，溶解后加入30g蔗糖并加热溶解，调pH至5.8～6.0，然后加入2mg的2,4-D和1.5mg的6-BA；

S3，取出带有愈伤组织的果肉，切下愈伤组织，置于继代培养基中，25～28℃暗培养，28-32d继代一次，直至获得白色疏松的南果梨愈伤组织。

优选的，上述南果梨愈伤组织的培养方法，S1的具体步骤为：南果梨果实保留2～4cm长的果柄，先在体积分数70％乙醇溶液浸泡消毒1min，再放入1.8g/100ml的次氯酸钠溶液浸泡消毒30min，无菌水清洗4～5次，得到无菌果实。

优选的，上述南果梨愈伤组织的培养方法，S2中，切下的果肉的厚度为1mm。