[发明专利]一种人皮肤角质形成层细胞的分离及培养方法

权利要求书

1.一种人皮肤角质形成层细胞的分离及培养方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）无菌条件下切取新鲜皮肤组织，4℃密封运回实验室；（2）无菌操作台内，预冷PBS清洗皮肤组织3次，剔除表面血管、脂肪、结缔组织；（3）剪碎组织，并用中性蛋白酶4℃消化；（4）分离真皮与表皮；（5）表皮组织用预热的胰蛋白酶继续消化；（6）终止消化，离心，弃上清；（7）取细胞滤液用锥虫蓝染色检测细胞活性；（8）细胞计数后用完全培养基重悬接种到包被后的培养瓶，置于37℃、5% CO₂环境中培养；（9）差速贴壁法去除成纤维细胞；（10）细胞鉴定。

2.根据权利要求1所述的人皮肤角质形成层细胞的分离及培养方法，其特征在于步骤（3）所用的中性蛋白酶浓度为0.1%~0.5%，消化时间15~20h。

3.根据权利要求1所述的人皮肤角质形成层细胞的分离及培养方法，其特征在于步骤（5）所用胰蛋白酶含0.01%的EDTA以吸收组织中的Ca²⁺、Mg²⁺，从而进一步促进细胞分离。

4.根据权利要求1所述的人皮肤角质形成层细胞的分离及培养方法，其特征在于步骤（5）所用的胰蛋白酶浓度为0.05%~0.2%，消化时间10~20min，。

5.根据权利要求1所述的人皮肤角质形成层细胞的分离及培养方法，其特征在于步骤（6）所用的离心速度为300~400g，离心时间5~8min。

6.根据权利要求1所述的人皮肤角质形成层细胞的分离及培养方法，其特征在于步骤（8）所述完全培养基为含10%胎牛血清，100u/ml的青霉素、100u/ml的链霉素，5μg/ml的胰岛素的DMEM/F12（1:1）培养基。

7.根据权利要求1所述的人皮肤角质形成层细胞的分离及培养方法，其特征在于步骤（8）所述的培养瓶用3~4μg/cm²的多聚赖氨酸包被。

8.根据权利要求1所述的人皮肤角质形成层细胞的分离及培养方法，其特征在于步骤（9）所用差速贴壁法的差速时间为15~30min。