[发明专利]一种人皮肤角质形成层细胞的分离及培养方法

说明书

本发明提供了一种人皮肤角质形成层细胞的分离及培养方法，包括以下步骤：（1）切取新鲜皮肤组织，4℃运回实验室；（2）PBS清洗3次；（3）剪碎组织，并用中性蛋白酶4℃消化；（4）分离真皮与表皮；（5）表皮组织用预热的胰蛋白酶继续消化；（6）终止消化，离心，弃上清；（7）锥虫蓝染色检测细胞活性；（8）细胞计数后用完全培养基重悬接种到包被后的培养瓶，置于37℃、5%CO₂环境中培养；（9）差速贴壁法去除成纤维细胞；（10）细胞鉴定。本发明提供的一种人皮肤角质形成层细胞的分离及培养方法，操作简单，所得细胞数量多，成活率高，是一种理想的人皮肤角质形成层细胞分离与培养方法，为实验提供可靠的细胞资源。

技术领域

本发明属于现代生物技术之细胞培养技术领域，具体涉及一种人皮肤角质形成层细胞的分离及培养方法。

背景技术

皮肤在机体免疫和内分泌等方面有重要作用，是人体的生理屏障之一。角质形成层细胞是表皮细胞的重要组成部分。人皮肤角质形成层细胞的体外培养为皮肤病、皮肤烧伤治疗等研究提供新的途径。人皮肤角质形成层细胞贴壁生长，形态呈椭圆形。通过原代培养获取的人皮肤角质形成层细胞可以避免细胞系长期传代对细胞特性的影响，为各种实验的研究提供可靠的资料。

目前常用的分离人皮肤角质形成层细胞的方法有组织块贴壁法和酶消化法。

组织块贴壁法分离得到的细胞纯度不高，数量少，并且培养时间较长。

本发明在传统酶消化法基础上进行改良，采用两种酶分步消化法结合差速贴壁法的方法，旨在提供一种操作简单、高效的获得生长状态好、纯度高的人皮肤角质形成层细胞的分离培养方法，建立一套完善可靠的人皮肤角质形成层细胞体外培养技术。

发明内容

根据上述问题，本发明提供了一种人皮肤角质形成层细胞的分离及培养方法，该方法操作简单，细胞纯度高，细胞产量和成活率高，是一种较为理想的人皮肤角质形成层细胞培养方法，可以满足多种生理生化实验的要求。

一种人皮肤角质形成层细胞的分离及培养方法步骤包括：（1）无菌条件下切取新鲜皮肤组织，4℃密封运回实验室；（2）无菌操作台内，PBS清洗皮肤组织3次，剔除表面血管、脂肪、结缔组织；（3）剪碎组织，并用中性蛋白酶4℃消化；（4）分离真皮与表皮；（5）表皮组织用预热的胰蛋白酶继续消化；（6）终止消化，离心，弃上清；（7）取细胞滤液用锥虫蓝染色检测细胞活性；（8）细胞计数后用完全培养基重悬接种到包被后的培养瓶，置于37℃、5% CO₂环境中培养；（9）差速贴壁法去除成纤维细胞；（10）细胞鉴定。

其中，步骤 （2）所述的PBS已4℃预冷，PBS浓度为0.01M，PH为7.2~7.4，培养皿置于无菌操作台内的冰上，是为了使组织处于无菌、低温的环境 。

其中，步骤（3）所用的中性蛋白酶浓度为01%~0.5%，消化时间15~20h。

其中，步骤（5）所用的胰蛋白酶含0.01%的EDTA以吸收组织中的Ca²⁺、Mg²⁺，从而进一步促进细胞分离。

其中，步骤（5）所用的胰蛋白酶浓度为0.05%~0.2%，消化时间10~20min。

其中，步骤（6）所用的离心速度为300~400g，离心时间5~8min。

其中，步骤（8）所述完全培养基为DMEM/F12（1:1）培养基，含10%胎牛血清，100u/ml的青霉素、100u/ml的链霉素，5μg/ml的胰岛素。

其中，步骤（8）所述的培养瓶用3~4μg/cm²的多聚赖氨酸包被。

其中，步骤（9）所用差速贴壁法的差速时间为15~30min。

有益效果