[发明专利]通过内部标准物质谱检测微生物的内标校正方法

说明书

本发明提供一种通过内部标准物来质谱检测微生物的方法，该内部标准物具有已知的分子量和质荷比，其在微生物检测过程中并不干扰微生物特征蛋白的峰值谱图。本发明还提供了所述内部标准物组合、试剂组合物及其相关检测产品。本发明中利用内部标准物质校正单个微生物样品检测的方法，可适用于包括真菌，细菌等各类用于MALDI‑TOF MS检测的微生物样品中，提高微生物鉴定的准确率，同时弥补了目前市场上只有外部标准物做校正的不足。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及用于飞行时间质谱系统检测微生物样品检测的内标校正。

背景技术

基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(Matrix-assisted laser desorptionlionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)技术，是近年来飞速发展的蛋白质组学、基因组学技术之一，具 有灵敏度高、准确度高及分辨率高等特点，为生命科学研究与临床重大疾病预警和辅助诊断等提供快 速、高通量的分析测试手段，同时也是一种很好的鉴定病原微生物的方法。

MALDI-TOF-MS的原理是用激光照射样品与基质形成的共结晶薄膜，基质从激光中吸收能量传 递给生物分子，而电离过程中将质子转移到生物分子或从生物分子得到质子，而使生物分子电离的过 程。TOF的原理是离子在电场作用下加速飞过飞行管道，根据到达检测器的飞行时间不同而被检测即 测定离子的质荷比(M/Z)与离子的飞行时间成正比，检测离子。尽管MALDI-TOF-MS的准确度高 达0.1％～0.01％，远远高于目前常规应用的SDS电泳与高效凝胶色谱技术。MALDI-TOF MS技术具有 快速、准确、稳定、高通量、低成本等特点；MALDI-TOF MS技术是临床微生物的常规快速分析技 术，也是耐药微生物的分析技术之一；MALDI-TOF MS技术为有病原菌资源库的构建提供了有效的 鉴定技术支持。但由于系统误差等因素影响实验结果的精确定量，因此在质谱检测样品时，引入已知 浓度和比例的内标，从而提高单个微生物样品鉴定的准确度和精密度。

目前曲线拟合的方法在国内外均有较为普遍的应用，Jiangyue Wu等(Anal.Chem.1997,69, 3767-3771)利用MALDI-TOF-MS的拟合曲线法对环孢菌素进行了定量测试；Mazarin等(Anal.Chem. 2006,78,2758-2764)结合脉冲梯度旋转核磁共振和MALDI-TOF-MS定量测定多聚物时，同样采用了 拟合曲线进行数据校正；2009年，吕爽等人利用拟合曲线，成功开发了一种磷酸化肽的 MALDI-TOF-MS定量方法。

该技术是在完整的微生物中添加酸性基质辅助细胞裂解，激光激发细胞裂解物(小蛋白或多肽)形 成肽质量指纹谱，与已构建的属、种水平的共性参考谱库进行比对分析，从而实现微生物的鉴定。而 各种特征肽或肽指纹的检测结果通过一系列具有特定质荷比(M/Z)的峰值曲线进行标识。在利用 MALDI-TOF MS质谱仪采集样本的准确性是蛋白指纹谱微生物识别体系的关键因素，如果在检测过 程中由于细胞裂解物的杂质或系统误差(继续补充)的影响，会导致检测结果的峰值曲线出现一定程 度的误差(例如1-10个Da分子量的峰值偏移)，因此一般需要通过标准物进行校正，以使得测定峰 值曲线与实际峰值曲线吻合。

袁湘林等(《分析化学研究报告》，2001年第29卷第1期)报道了在基体辅助激光解吸电离飞行时间质谱用于人参皂甙Rg3的定量分析中，选择芦丁作为内标物,在重现性和线性方面都优于棉子糖。分辨率的提高以及以相对峰面积代表待测物浓度，可使平均相对误差明显降低,改善定量结果。然而，该方法并非用于质谱检测微生物中，与MALDI-TOF MS检测微生物采用的线性模式不同的是，人参皂甙Rg3的定量分析所采用的是反射模式，且待测样品的检测范围小于1000Da，同时其检测区间仅限于400-900(M/Z)，无法满足微生物的检测区间，因此受到了限制。