[发明专利]一种积累乙酰氨基葡萄糖的重组枯草芽孢杆菌及其应用

说明书

本发明公开了一种积累乙酰氨基葡萄糖的重组枯草芽孢杆菌及其应用，属于遗传工程领域。本发明是以重组枯草芽孢杆菌BSGN11作为出发菌株，通过在关键酶氨基葡萄糖乙酰化酶CeGNA1的N端融合标签，提高其翻译初始速率，从而提高其表达量，促进宿主菌利用丙酮酸的能力，进而将流向丙酮酸的代谢流引流至乙酰氨基葡萄糖合成途径，减弱丙酮酸积累对细胞的抑制作用。本发明得到了一株乙酰氨基葡萄糖积累量提高的枯草芽孢杆菌基因工程菌，摇瓶水平上产量达到9.4g/L，为进一步代谢工程改造枯草芽孢杆菌生产氨基葡萄糖奠定了基础。

技术领域

本发明涉及一种积累乙酰氨基葡萄糖的重组枯草芽孢杆菌及其应用，属于遗传工程领域。

背景技术

N-乙酰氨基葡萄糖是一种重要的功能单糖。N-乙酰氨基葡萄糖及其衍生物氨基葡萄糖具有重要的生理功能，由于其促进骨关节增生和修复、抗炎症作用其在医药保健品领域有着广泛的应用。目前微生物发酵法生产N-乙酰氨基葡萄糖是研究的较多的一种绿色环保的生产方法。而由于枯草芽孢杆菌具有食品安全的特性，用其作为生产菌株具有更广阔的前景。因此，运用代谢工程手段构建重组枯草芽孢杆菌是生产食品安全级乙酰氨基葡萄糖的有效途径。

在前期的研究过程中，使用无痕同源重组技术构建重组枯草芽孢杆菌BSGN11，通过阻断碳代谢副产物乙偶姻和乙酸的合成，迫使代谢流在丙酮酸节点处积累。虽然在发酵罐中通过恒pH补料分批发酵，在一定程度提高了产N-乙酰氨基葡萄糖的产量，但是在摇瓶发酵中由于无法控制pH，丙酮酸的积累抑制了细胞生长和目的产物GlcNAc的合成，限制了后期工程菌的代谢改造。因此，提供一种乙酰氨基葡萄糖合成量提高，并且避免面丙酮酸的积累重组菌，从而适用于工业化生产。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种高产乙酰氨基葡萄糖的重组菌，所述重组菌以枯草芽孢杆菌为宿主，将纯化标签融合到6-磷酸-氨基葡萄糖乙酰化酶N端然后连接到表达载体上，转入宿主中得到。

在本发明的一种实施方式中，所述纯化标签为HA或cMyc。

在本发明的一种实施方式中，所述纯化标签HA的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所述，所示纯化标签cMyc的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示

在本发明的一种实施方式中，所述纯化标签HA的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，所示纯化标签cMyc的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。

在本发明的一种实施方式中，所述6-磷酸-氨基葡萄糖乙酰化酶的来源为秀丽隐杆线虫。

在本发明的一种实施方式中，所述6-磷酸-氨基葡萄糖乙酰化酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.7。

在本发明的一种实施方式中，所述宿主为枯草芽孢杆菌BSGN11，所述枯草芽孢杆菌BSGN11的构建方法参见：Metabolic engineering of carbon overflow metabolism ofBacillus subtilis for improved N-acetyl-glucosamine production.Bioresourcetechnology,2018,250:642-649。

在本发明的一种实施方式中，所述表达载体为pP43-CeGNA1，所述pP43-CeGNA1的构建方法参见乙酰氨基葡萄糖合成关键酶GlmS和Gna1的筛选及催化动力学分析，江南大学学位论文，徐小芳，2016。

本发明第二个目的是提供一种高产乙酰氨基葡萄糖的重组菌的构建方法，所示方法的具体步骤如下：将纯化标签融合到质粒pP43-CeGNA1上，得到重组表达载体，将所述重组表达载体转化入枯草芽孢杆菌BSGN11，得到积累乙酰氨基葡萄糖的重组枯草芽孢杆菌。