[发明专利]ATP硫酸化酶活性的检测方法

权利要求书

1.一种ATP硫酸化酶活性的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)先将不同浓度焦磷酸PPi分别和腺苷-5’-三磷酸APS、荧光素luciferin、荧光素酶luciferase混合，得到不同浓度PPi的混合物；所述不同浓度焦磷酸PPi分别为1nM、5nM、10nM、50nM、100nM、200nM、300nM和400nM的PPi，体积均为30uL；

(2)将每个PPi浓度的混合物分成体积相同的两等份，一份加入测试样品池，另一份加入对照样品池；

(3)在对照样品池中再注入缓冲液，在测试样品池中注入三磷酸腺苷ATP硫酸化酶，测试样品池发生酶促反应：

根据上述反应可知：PPi通过上述反应以1:1化学计量生成ATP，终态ATP的浓度等同于初态PPi的浓度；

其中ATP sulfurylase表示三磷酸腺苷硫酸化酶，k₊表示ATP sulfurylase同时与PPi和APS的结合速率；k_表示ATP sulfurylase与PPi和APS完全解离的速率；k_cat表示ATPsulfurylase对PPi的催化速率；

(4)开启反应动力学定量探测仪，检测测试样品池中的产物ATP与荧光素、荧光素酶反应产生的荧光强度，旋转测试转盘后检测对照样品池中的荧光强度，在控制器的控制面板中分别显示测试样品池的荧光强度-时间曲线f_ATP和对照样品池的荧光强度-时间曲线f_Control；

(5)针对不同浓度PPi的混合物，测得每个浓度对应的ATP荧光强度F_ATP，其中F_ATP≡[f_ATP-f_Control]_t→∞，其中t为检测时间，即F_ATP为与ATP浓度对应的稳态时测试样品池的荧光强度减去对照样品池的荧光强度，进而生成F_ATP-ATP浓度校准曲线；

(6)制作米氏曲线：

根据所得到的校准曲线，按照以下公式拟合得到比例常数α₉：

在线性区间:

[ATP]＝α₉F_ATP，

[ATP]表示ATP的浓度；

通过以下公式将测试样品池的荧光强度-时间曲线在起始点的导数换算成该PPi浓度对应的反应速率：

t为检测时间；

以PPi浓度为横坐标，反应速率为纵坐标，在坐标系中标出PPi浓度所对应的反应速率，连接这些点，制作得到米氏曲线；

(7)求出V_max：

根据米氏公式：

其中，V_PPi表示上述反应速率，[PPi]表示PPi的浓度，V_max表示最大速率，K_M表示米氏常数；

拟合所得的V_max即是衡量ATP硫酸化酶活性的参数。

2.根据权利要求1所述的ATP硫酸化酶活性的检测方法，其特征在于，所述ATP硫酸化酶加入量为30uL，浓度为1nM。

3.根据权利要求1所述的ATP硫酸化酶活性的检测方法，其特征在于，所述缓冲液加入量为30uL；

缓冲液按照以下配比配置:130mM NaCl，5mM KCl，1.5mM CaCl₂，1mM MgSO₄，5mM葡萄糖和0.1％牛血清白蛋白；pH＝7.4。

4.根据权利要求1-3任一项所述的ATP硫酸化酶活性的检测方法，其特征在于，所述荧光素和荧光素酶的总体积为10uL。

5.根据权利要求1-3任一项所述的ATP硫酸化酶活性的检测方法，其特征在于，所述APS的浓度为1nM，体积为30uL。