[发明专利]ATP硫酸化酶活性的检测方法

说明书

本申请公开了一种ATP硫酸化酶活性的检测方法，包括以下步骤：(1)先将不同浓度焦磷酸分别和腺苷5’三磷酸、荧光素/荧光素酶混合，得到混合物；(2)将混合物分成两等份后分别加入测试样品池和对照样品池；(3)在对照样品池中再注入缓冲液，在测试样品池中注入ATP硫酸化酶；(4)开启探测仪，检测测试样品池中的产物ATP与荧光素/荧光素酶反应产生的荧光强度和对照样品池中的荧光强度，得到荧光强度时间曲线；(5)针对不同标准浓度的PPi，测得对应的F_PPi，生成校准曲线；(6)制作米氏曲线：(7)根据米氏公式，拟合所得的Vmax即是衡量ATP硫酸化酶活性参数；(8)判断ATP硫酸化酶活性。采用本发明的检测方法能够方便快捷的检测ATP硫酸化酶活性。

技术领域

本申请涉及一种检测方法，具体涉及ATP硫酸化酶活性的检测方法。

背景技术

ATP硫酸化酶能够将焦磷酸(PPi)与腺苷5’三磷酸(APS)耦合并催化成三磷酸腺苷(ATP)，其活性直接影响催化速率及检测灵敏度。而PPi是生命体内重要的能量代谢分子，对其的快速实时定量检测能间接探测生命体的能量代谢过程，尤其是主要代谢路径的识别。

现在还没有一种能够方便快捷的检测ATP硫酸化酶活性的方法。

发明内容

鉴于现有技术中的上述缺陷或不足，期望提供一种能够方便快捷的检测ATP硫酸化酶活性的方法。

为了实现上述目的，本发明采取的技术方案是：

一种ATP硫酸化酶活性的检测方法，包括以下步骤：

(1)先将不同浓度焦磷酸PPi分别和腺苷5’三磷酸APS、荧光素luciferin/荧光素酶luciferase混合，得到不同浓度PPi的混合物；

(2)将每个PPi浓度的混合物分成体积相同的两等份，一份加入测试样品池，另一份加入对照样品池；

(3)在对照样品池中再注入缓冲液，在测试样品池中注入三磷酸腺苷ATP硫酸化酶，则测试样品池发生酶促反应：

根据上述反应可知：PPi通过上述反应以1:1化学计量生成ATP，终态ATP的浓度等同于初态PPi的浓度；

其中ATP sulfurylase表示三磷酸腺苷硫酸化酶，k₊表示ATP sulfurylase同时与PPi和APS的结合速率；k--表示ATP sulfurylase与PPi和APS完全解离的速率；k_cat表示ATPsulfurylase对PPi的催化速率；

(4)开启反应动力学定量探测仪，检测测试样品池中的产物ATP与荧光素/荧光素酶反应产生的荧光强度，旋转测试转盘后检测对照样品池中的荧光强度，在控制器的控制面板中分别显示测试样品池和对照样品池的荧光强度时间曲线；

(5)针对不同标准浓度PPi的混合物，测得每个浓度对应的PPi荧光强度F_PPi，进而生成校准曲线；

(6)制作米氏曲线：

根据所得到的校准曲线，按照以下公式拟合得到比例常数α₉：

在线性区间:

[ATP]＝α₉FATP，

[ATP]表示ATP的浓度；F_ATP为与[ATP]对应的稳态时测试样品池荧光强度减去对照样品池的荧光强度；

所述荧光强度时间曲线在起始点的导数即可换算成该PPi浓度对应的反应速率：