[发明专利]一种用于淡水螯虾细胞外源基因表达的转染方法及其应用

权利要求书

1.适用于淡水螯虾造血组织细胞外源基因表达的转染方法，其特征在于将外源重组质粒导入淡水螯虾造血组织细胞中，并且实现目的基因大量表达的过程，具体包括以下步骤：

1)使用适用于淡水螯虾造血组织细胞外源基因表达的表达载体，构建包含目的基因片段的重组质粒；

所述适用于淡水螯虾造血组织细胞外源基因表达的表达载体为适用于淡水螯虾造血组织细胞外源基因表达的强启动子序列信息合成DNA后，将该DNA片段插入经过改造的昆虫表达质粒pIZ/V5-His，获得重组表达载体pIZ-wsv249p/V5-His，该重组质粒在大肠杆菌(Escherichia coli)中大量复制，或在淡水螯虾造血组织细胞中实现目的基因的表达，所述经过改造为去掉载体自身带有的多克隆位点前的启动子；

所述适用于淡水螯虾造血组织细胞外源基因表达的强启动子序列为一段DNA核苷酸序列，该序列来源自白斑综合症病毒的极早期基因wsv249的启动子区域，经过筛选比较，发现其在淡水螯虾造血组织细胞中具有强启动子活性，应用于下游重组表达载体的构建，该序列长度为332bp，类型为核酸，链性为双链，拓扑结构为线性，序列如下所示，记为SEQ IDNo.1：

2)淡水螯虾造血组织细胞的分离、培养和预处理；

3)使用适用于淡水螯虾造血组织细胞外源基因表达的电穿孔系统以及特定的操作参数，对淡水螯虾造血组织细胞进行重组质粒的转染；

所述适用于淡水螯虾造血组织细胞外源基因表达的电穿孔系统是Celetrix^TM电转仪、相关的电击管与电转液在淡水螯虾造血组织细胞外源基因转染表达中的应用，特定的操作参数为电压400V，电脉冲时间30ms，电脉冲次数1次；

4)目的基因在淡水螯虾造血组织细胞表达的检测。