[发明专利]一种用于淡水螯虾细胞外源基因表达的转染方法及其应用

说明书

一种用于淡水螯虾细胞外源基因表达的转染方法及其应用，涉及水产动物学领域的生物技术。提供适用于淡水螯虾造血组织细胞外源基因表达的强启动子序列、适用于淡水螯虾造血组织细胞外源基因表达的表达载体、适用于淡水螯虾造血组织细胞外源基因表达的电穿孔系统以及特定的操作参数和适用于淡水螯虾造血组织细胞外源基因表达的转染方法。使用含有白斑综合症病毒的极早期基因wsv249启动子序列的重组质粒和Celetrix^TM电穿孔系统，对转染淡水螯虾造血组织细胞的操作步骤和技术参数进行摸索，建立一套成功实现淡水螯虾造血组织细胞外源基因表达的操作参数和方法。

技术领域

本发明涉及水产动物学领域的生物技术，尤其是涉及一种用于淡水螯虾细胞外源基因表达的转染方法及其应用。

背景技术

我国是水产养殖大国，虾类养殖业(包括海水对虾和淡水螯虾)是我国许多地区的重要经济产业。但近年来病害问题包括细菌病，真菌病，病毒病等持续突出，使得海水对虾养殖成功率低，2015年中国对虾养殖成功率不到一成，整体产业处于低迷、不景气的状态。相较于海水对虾，淡水螯虾属于外来物种，对养殖环境要求相对较低，但是近年来由于养殖面积大量扩张，养殖密度不断增大，使得以前很少发病的淡水螯虾情况也不甚理想。病害问题严重影响着虾类养殖产业的发展，而获得有效的病害防御方法和抗病良种成为了近年来养殖户的迫切需求。为此中国、美国、瑞典、日本、泰国、越南等国科学家对虾的免疫防御机制以及病害的入侵机制都开展了广泛的研究，但目前所获得的信息还非常有限，这严重影响了对生产实践的指导。究其原因，很大程度上是由于缺乏相关外源基因转染表达的研究平台，使一些关键问题无法深入探讨。因此，本发明创造性地建立一套转染方法，首次攻克这一技术难题，并为其扩展应用提供了可能。

发明内容

本发明的第一目的是提供一段适用于淡水螯虾造血组织细胞外源基因表达的强启动子序列。

本发明的第二目的是提供一个适用于淡水螯虾造血组织细胞外源基因表达的表达载体。

本发明的第三目的是提供一套适用于淡水螯虾造血组织细胞外源基因表达的电穿孔系统以及特定的操作参数。

本发明的第四目的是提供一种适用于淡水螯虾造血组织细胞外源基因表达的转染方法。

所述一段适用于淡水螯虾造血组织细胞外源基因表达的强启动子序列为一段DNA核苷酸序列，该序列来源自白斑综合症病毒的极早期基因wsv249的启动子区域，经过筛选比较，发现其在淡水螯虾造血组织细胞中具有强启动子活性，可应用于下游重组表达载体的构建。该序列长度为332bp，类型为核酸，链性为双链，拓扑结构为线性，序列如下所示，记为SEQ ID No.1：

所述适用于淡水螯虾造血组织细胞外源基因表达的表达载体为所述适用于淡水螯虾造血组织细胞外源基因表达的强启动子序列信息合成DNA后，将该DNA片段插入经过改造的昆虫表达质粒pIZ/V5-His，获得重组表达载体pIZ-wsv249p/V5-His，该重组质粒可以在大肠杆菌(Escherichia coli)中大量复制，也可以在淡水螯虾造血组织细胞中实现目的基因的表达，所述经过改造为去掉载体自身带有的多克隆位点前的启动子。

所述适用于淡水螯虾造血组织细胞外源基因表达的电穿孔系统以及特定的操作参数是Celetrix^TM电转仪、相关的电击管与电转液在淡水螯虾造血组织细胞外源基因转染表达中的应用，特定的操作参数为电压400V，电脉冲时间30ms，电脉冲次数1次。

所述适用于淡水螯虾造血组织细胞外源基因表达的转染方法是将外源重组质粒导入淡水螯虾造血组织细胞中，并且实现目的基因大量表达的过程，具体包括以下步骤：

1)使用所述适用于淡水螯虾造血组织细胞外源基因表达的表达载体，构建包含目的基因片段的重组质粒；

2)淡水螯虾造血组织细胞的分离、培养和预处理；