[发明专利]通过miRNA let-7b调控GHR基因表达的方法

权利要求书

1.通过miRNA let-7b调控GHR基因表达的方法，其特征在于包括以下步骤：

1-1)使用序列如SEQ ID № 1和2所示的引物扩增let-7b所在的基因组，经电泳分离后回收目的片段；

1-2)将PCR所得的目的片段与载体pEASY-T1连接，并且转化至感受态细胞进行单克隆培养；

1-3)抽提质粒，并且分别用NotⅠ与ApaⅠ酶切pcDNA3.1-EGFP质粒载体和前体miRNA及其侧翼序列的T克隆载体pEASY-T1-pre-let-7b，37℃温育5h；

1-4)电泳pcDNA3.1-EGFP和pEASY-T1-pre-let-7b质粒载体的酶切产物，回收电泳酶切片段；将pcDNA3.1-EGFP质粒双酶切回收片段、pre-let-7b及其侧翼序列的双酶切回收产物，进行连接，轻轻混匀后16℃连接过夜，得到pcDNA3.1-EGFP-pre-let-7b表达质粒；

2-1)使用序列如SEQ ID № 3和4所示的引物扩增GHR基因，经电泳分离后回收目的片段；

2-2)将PCR所得的目的片段与载体pEASY-T1连接，并且转化至感受态细胞进行单克隆培养；

2-3)抽提质粒，并且分别用SacI，XbaI双酶切pmirGLO质粒载体以及靶基因3'UTR序列的T克隆载体pEASY-let-7b-GHR，37℃温育5h；

2-4)；电泳pmirGLO和pEASY-let-7b-GHR质粒载体的酶切产物，回收电泳酶切片段；将pmirGLO质粒线性化回收片段与靶基因3'UTR序列的T载体双酶切回收产物，进行连接，轻轻混匀后16℃连接过夜，得到pmirGLO-let-7b-GHR 3'UTR表达质粒；

3-1)将来源于ELL鸡胚胎的DF-1细胞培养在含10％胎牛血清的DMEM培养基中；

3-2)将靶基因GHR的3'UTR靶序列插入到萤火虫荧光素酶基因下游，载体pcDNA-EGFP-pre-let-7b分别与载体pmirGLO-let-7b-GHR 3'UTR共转染到DF-1细胞中，并分别设置空质粒载体与let-7b表达载体共转染对照。

2.根据权利要求1所述的通过miRNAlet-7b调控GHR基因表达的方法，其特征在于，所述步骤1-1采用的PCR扩增反应体系包括：5μL的10×TransTaq HiFi Buffer，4μL 2.5mmol/L的dNTP Mixture，序列如SEQ ID № 1和2所示的引物各0.5μL，0.5μL的TransTaq HiFi DNAPolymerase，2μL的模板DNA，适量灭菌蒸馏水。

3.根据权利要求1所述的通过miRNA let-7b调控GHR基因表达的方法，其特征在于，所述步骤1-2的转化具体包括：无菌状态下取感受态细胞50μL置于无菌的1.5mL的离心管中；将5μL的连接产物加入其中并用取样器轻轻吹打混匀，冰浴30min；将管于42℃的水浴放置90s，不要摇动离心管；快速将离心管转移到冰上，冰浴2min；往管中加入600μL的液体LB，37℃摇床220rpm/min培养60min；取400μL菌液涂布于含有氨苄青霉素的琼脂平板上，37℃培养12～16h。

4.根据权利要求1所述的通过miRNA let-7b调控GHR基因表达的方法，其特征在于，所述步骤3-2中，具体的转染步骤包括：50μL OPTI-MEMI培养基稀释2μL Lipofectamine 2000试剂后孵育5min；混合需转染的DNA和稀释的Lipofectamine 2000，室温孵育20min后直接将复合物加到含0.4mL OPTI-MEMI培养基的细胞中，轻轻摇动培养板混匀；在37℃，5％CO₂培养箱培养5h后换0.5mL含10％FBS，不含抗生素的正常DMEM培养基，在37℃，5％CO₂培养箱中培养36h，收集细胞。