[发明专利]通过miRNA let-7b调控GHR基因表达的方法

说明书

本发明公开了一种通过miRNA let‑7b调控GHR基因表达的方法，包括以下步骤：1)pcDNA3.1‑EGFP‑pre‑let‑7b表达质粒的构建；2)pmirGLO‑let‑7b‑GHR 3'UTR表达质粒的构建；3)萤火虫/海肾双荧光素酶报告系统进行靶标验证。本发明提供的GHR基因表达的调控方法，通过将let‑7b过表达载体转染DF‑1细胞后，降低了GHR的蛋白质表达量，有效使得荧光素酶相对活性明显下降，从而调控GHR基因表达。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及通过miRNA let-7b调控GHR基因表达的方法。

背景技术

miRNA是一类大小约为22个核苷酸的内源性非编码小RNA。研究表明，miRNA通过与其靶基因mRNA的结合，影响基因的转录、蛋白质的合成等，参与众多生物学过程，影响动物的生长发育。虽然，到目前为止，科学工作者已经发现了许多的miRNA分子，也对它们的作用有了一定的了解，但是，仍有许多关于基因与miRNA的未解之谜。要解决这些问题，最简捷有效的方法便是从研究和发现更多的miRNA及其靶基因入手，以miRNA与其靶基因之间的关系作为研究方向，进行生物学功能验证，以便让我们更多了解生物的生命意义。

鉴于生长激素受体(Growth Hormone Receptor，GHR)基因在鸡的生长发育过程中具有重要作用，我们采用萤火虫/海肾双荧光素酶报告系统进行靶标验证，以确定let-7b与GHR基因是否存在确切的靶标关系。

发明内容

本发明提供一种通过miRNA let-7b调控GHR基因表达的方法，包括以下步骤：

1-1)使用序列如SEQ ID №1和2所示的引物扩增let-7b所在的基因组，经电泳分离后回收目的片段；

1-2)将PCR所得的目的片段与载体pEASY-T1连接，并且转化至感受态细胞进行单克隆培养；

1-3)抽提质粒，并且分别用NotⅠ与ApaⅠ酶切pcDNA3.1-EGFP质粒载体和前体miRNA及其侧翼序列的T克隆载体pEASY-T1-pre-let-7b，37℃温育5h；

1-4)电泳pcDNA3.1-EGFP和pEASY-T1-pre-let-7b质粒载体的酶切产物，回收电泳酶切片段；将pcDNA3.1-EGFP质粒双酶切回收片段、pre-let-7b及其侧翼序列的双酶切回收产物，进行连接，轻轻混匀后16℃连接过夜，得到pcDNA3.1-EGFP-pre-let-7b表达质粒；

2-1)使用序列如SEQ ID №3和4所示的引物扩增GHR基因，经电泳分离后回收目的片段；

2-2)将PCR所得的目的片段与载体pEASY-T1连接，并且转化至感受态细胞进行单克隆培养；

2-3)抽提质粒，并且分别用SacI，XbaI双酶切pmirGLO质粒载体以及靶基因3'UTR序列的T克隆载体pEASY-let-7b-GHR，37℃温育5h；

2-4)；电泳pmirGLO和pEASY-let-7b-GHR质粒载体的酶切产物，回收电泳酶切片段；将pmirGLO质粒线性化回收片段与靶基因3'UTR序列的T载体双酶切回收产物，进行连接，轻轻混匀后16℃连接过夜，得到pmirGLO-let-7b-GHR 3'UTR表达质粒；

3-1)将来源于ELL鸡胚胎的DF-1细胞培养在含10％胎牛血清的DMEM培养基中；

3-2)将靶基因GHR的3'UTR靶序列插入到萤火虫荧光素酶基因下游，载体pcDNA-EGFP-pre-let-7b分别与载体pmirGLO-let-7b-GHR3'UTR共转染到DF-1细胞中，并分别设置空质粒载体与let-7b表达载体共转染对照。