[发明专利]一种家蝇抗菌肽MAF-1A肽聚体、其编码基因及其表达和应用

说明书

本发明提供了一种家蝇抗菌肽MAF‑1A肽聚体及其编码基因的序列，以及包含该编码基因的重组载体和菌株；还提供了诱导所述菌株表达家蝇抗菌肽MAF‑1A肽聚体的方法，通过所述方法得到的MAF‑1A单体量可达2.0mg/mL；另外，还验证了通过该家蝇抗菌肽MAF‑1A肽聚体获得的MAF‑1A单体的抗菌活性；表明以通过构建的串联表达系统有效获取具有抗菌活性的MAF‑1A单体。不仅解决了小分子多肽单体不易分离、鉴定的问题，也提高了表达效率，说明通过本发明所得到的MAF‑1A在抗真菌药中具有较大的应用潜力。

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种家蝇抗菌肽MAF-1A肽聚体、其编码基因及其表达和应用。

背景技术

近年来，真菌感染性疾病的发病率不断增高，其中白色念珠菌(Candidaalbicans)是主要病原体之一。使用抗真菌药物是控制真菌感染的主要手段，但随着耐药菌株的不断增加，抗真菌药物种类较少及抗真菌药物的毒副作用等问题的出现，寻找新药源、研发新型安全有效的抗真菌感染治疗药物已经成为医学科研工作者迫切需要解决的问题。

抗菌肽(Antimicrobial peptides，AMPs)是生物体内具有抑杀细菌、真菌、病毒以及肿瘤细胞等生物活性的小分子肽类物质。由于AMPs具有抗菌谱广、低毒、不易产生耐药性等特点，因此受到广泛关注。家蝇抗菌肽MAF-1A(Musca domestica antifungalpeptide-1A)为家蝇抗真菌肽MAF-1C端第128位～153位功能结构域肽段，是来源于家蝇幼虫由26个氨基酸残基组成的线性小分子抗菌肽，分子量3022.5Da，其氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。发明人前期研究发现，MAF-1A为是一阳离子多肽，N端富含赖氨酸(Lys)，其二级结构主要为α-螺旋结构，具有较好的双亲性，且具有一定耐热性，MAF-1A可通过多靶点作用方式对白念珠菌药物敏感株及耐药菌株产生较强的抑杀作用，具有新型抗真菌药物的开发潜力(Wang T,Xiu J,Zhang Y,et al.Transcriptional Responses of Candida albicans toAntimicrobial Peptide MAF-1A[J].Front Microbiol,2017,8:894.DOI:10.3389/fmicb.2017.00894)(罗振华，吴建伟，付萍，等。人工合成家蝇抗真菌肽MAF-1A对白色念珠菌致病性的影响[J]。第三军医大学学报，2013，35(20)：2203～2207)。

尽管MAF-1A显示了作为新型肽类抗真菌药物的开发前景，但天然MAF-1A在虫体内含量极微，而且分离纯化困难，难以满足后续研究及产业化需求。目前，获得高纯度的AMPs途径主要包括化学合成以及重组表达,采用化学合成费用昂贵，而重组表达AMPs的生产成本低，提取工艺简单，产量高，能更好的满足研究和产业化需求(Klint JK,Senff S,SaezNJ,et al. Production of recombinant disulfide-rich venom peptides forstructural and functional analysis via expression in the periplasm of E.coli[J].PLoS One.2013,8(5):e63865.DOI:10.1371/journal. pone.0063865)。然而，小分子多肽的克隆表达、分离、纯化、鉴定都相对复杂，在表达宿主菌体内很容易降解(祁丽，姜宁，张爱忠，等。抗菌肽研发现状及其改造策略[J]。中国畜牧兽医，2016，43(2)：450～456)，因此作为由26个氨基酸残基构成的多肽MAF-1A，由于其相对分子量较小，也不适合直接在重组表达宿主中表达。

发明内容

为解决现有技术的不足，本发明采用基因工程技术生产MAF-1A，并且采用串联表达方式，以增加小分子多肽的表达量和稳定性、提高目的多肽的得率、保持多肽活性。