[发明专利]一种犬瘟热病毒可视化核酸检测方法

说明书

本发明涉及一种犬瘟热病毒的可视化快速检测方法，融合了免疫层析技术和分子生物学手段，结合LAMP扩增效率高和横向测流试纸条便于观察结果，使检测结果更具有直观性，具有可视化、快速诊断、准确等特点，解决传统检测方法操作繁琐、敏感性、特异性低的缺陷，本发明检测方法适用于临床诊断、食品安全和动物疾病检测等领域。

技术领域

本发明涉及一种犬瘟热病毒的可视化快速检测方法，用于动物犬瘟热的临床诊断，属于动物疫病检测技术领域。

背景技术

犬瘟热是由犬瘟热病毒（Canine Distemper Virus，CDV）引起的一种急性、高度传染性疾病，易感宿主广泛，不同物种间可交叉感染，该病感染性强，发病率高，引起的犬、猫科动物死亡率高达30-80%，是目前危害动物特别是宠物犬和经济动物（貂、狐、貉）健康的一种重要疫病。因此要从根本上控制和消灭犬瘟热疾病，必须对犬、猫科动物实行综合的预防控制措施。目前对于犬瘟热疾病的防控，最重要的手段是犬瘟热疫苗的免疫接种，但疫苗接种后动物体内是否产生了达到免疫保护水平的抗体，需要一定的检测方法。目前常用的有免疫学检测方法（如酶联免疫吸附试验ELISA，胶体金免疫层析试纸条等）和分子生物学方法（RT-PCR，实时荧光定量PCR等），但这些方法都需要一定的仪器设备和较高的操作技术，限制了在现场实时检测的推广应用。

环介导等温扩增技术（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是一种快速、简便的恒温扩增技术，针对靶基因的6个区域设计4条特异性引物，为了提高反应速率可以加入2条环引物，在恒温条件下利用链置换反应扩增靶序列。迄今已建立了多种针对病毒、细菌、微生物、寄生虫等方面LAMP检测方法。产物的检测方法有多种，如琼脂糖凝胶电泳、浊度仪检测焦磷酸镁沉淀、添加SYBR green I、钙黄绿素等荧光染料后肉眼观察颜色变化。但是琼脂糖凝胶电泳过程中易扩散气溶胶，产生假阳性；沉淀及染料易因颜色不明显而误判。为了弥补在结果呈现上的缺陷，我们采用与横向流动试纸条（Lateral flowdipstick，LFD）相结合的方法。此试纸条置于塑料外壳内可以防止气溶胶污染。RT-LAMP-LFD方法只需在两条环引物上分别标记生物素(Biotin)和异硫氰酸荧光素（Fluoresceinisothiocyanate，FITC）即可，含生物素标记的扩增产物与FITC标记的探针特异性杂交，从而与胶体金标记的抗FITC抗体形成三元复合物，而未杂交的FITC标记探针形成不含生物素的两元复合物，结合在抗FITC的质控线上。

发明内容

本发明是为了解决传统检测方法操作繁琐、敏感性、特异性低的缺陷，提供一种犬瘟热病毒的可视化快速检测方法，能够方便快捷地检测犬瘟热病毒。

本发明提供的一种犬瘟热病毒的可视化快速检测方法，包括以下步骤：

1）引物设计

根据GenBank中收录的CDV基因序列，利用DNAMAN软件进行对比与分析，筛选出N基因序列中同源性相对较高的保守区，利用软件Primer Explore 5针对靶基因在线设计6条引物：

F3 CCCAAGCATCAACTCTGT；

B3 ATTGCTCAGCATCATCAAC；

FIP CAAGCATCAACTCTGTTTG-GCCTCAGAATCCAAACTTG；

BIP CTTATTCTCCAACCAGCCT-TTGAGCTTTCGACCCTTC；

LF GTCTTACGTTTGCATCCAG；

LB AAGCTCAAGGGCAATTAGG；

其中，引物LF上标记生物素（Biotin）,引物LB上标记异硫氰酸荧光素(FITC)；